Appunti completi del corso "Chimica Analitica Strumentale"

Statistica

Esempio: analisi di piombo in acqua di rubinetto che dà come risultato 52 μg/L, sapendo che per legge la concentrazione massima consentita è 50 μg/L, il campione ha una concentrazione che eccede il limite di legge?

Se questi sono gli unici dati che si hanno, non si può rispondere a questa domanda perché l’incertezza di misura non è stata dichiarata, il dato deve essere quindi sempre affiancato dall’incertezza per sapere con quale precisione è stato misurato, se incertezza molto piccola allora il campione eccede il limite di legge, ma se l’incertezza è superiore a 2 allora il campione ha una concentrazione che non eccede il limite di legge.

L’incertezza di misura rappresenta l’intervallo entro il quale ci si aspetta che vadano a cadere, con una certa probabilità, misure replicate del campione. È molto importante riportare l’incertezza di misura, altrimenti il dato non ha significato, perché non si sa dire quanto è realistico e affidabile quel valore.

Quando si mette a punto un metodo analitico, si devono stabilire quali sono le figure di merito del protocollo analitico, cioè le caratteristiche del metodo quali: precisione, accuratezza, sensibilità, limite di rivelabilità e di quantificazione, intervallo di lavoro, selettività e robustezza.

• La robustezza identifica la capacità di un metodo di riuscire ad avere dati finali che non vengono influenzati dalla complessità della matrice. Un metodo è robusto se riesce a lavorare in modo preciso e accurato con matrici diverse tra loro mentre è poco robusto se una piccola variazione della concentrazione della matrice ha un effetto rilevante in termini di accuratezza e precisione, ad esempio i metodi UV-visibili perché la matrice deve essere fortemente trattata per diminuirne la complessità prima di eseguire l’analisi. Quindi è la capacità di riuscire a lavorare con matrici molto differenti.
• L’accuratezza è la differenza tra il valore vero e la media dei valori ottenuti dopo un certo numero di replicati, se tutti i dati sistematicamente sono superiori al valore vero si ha una media più alta. Un metodo analitico è tanto più accurato quanto più la differenza tra valore medio e media dei replicati è bassa. Un metodo è poco accurato quando x medio è molto distante dal valore vero.
• La precisione è la dispersione dei dati sulla curva. Un metodo è tanto più preciso quanto i dati replicati sono poco dispersi sull’asse delle x.

Errori

Ha senso parlare di probabilità quando un certo valore di replicato cade in un intervallo di differenti valori. In un grafico, la curva continua rappresenta la densità di probabilità, riportata sull’asse delle y, quindi per calcolare la probabilità si deve integrare la curva nell’intervallo preso.

Ogni volta che si fa una misura sperimentale si avranno degli errori nella misura che non ci permetteranno mai di ottenere valori uguali agli standard certificati, dovuti a errore umano o strumentale, questi errori sono definiti errori casuali che agiscono in modo random sulle analisi. Essi influenzano la larghezza della distribuzione dei dati, alcuni valori saranno minori o maggiori di x medio. Un metodo, quindi, è tanto più preciso quanto più gli errori casuali sono contenuti. Gli errori sistematici, invece, sono errori che agiscono sempre in una direzione determinati spesso da un interferente. La presenza di errore sistematico viene definito bias, ci sono casi in cui si può decidere di risolvere il problema operando in modo corretto e in altri in cui non è possibile avere una soluzione, ad esempio analisi del COD, determinazione cloruri, sempre in difetto, dato che il bias non è eliminabile si può correggere matematicamente applicando un fattore correttivo.

Esempio: si suppone di fare una retta di calibrazione in unità di assorbanza sull’asse delle y e sull’asse delle x la concentrazione. Si determini la concentrazione dei fosfati in acqua distillata misurando l’assorbanza e sfruttando l’equazione della retta per determinare la concentrazione. Se invece si analizza un campione in acqua di mare, 35 g/L NaCl, l’analisi all’UV-visibile fornisce una calibrazione diversa dalla precedente. Quindi per una matrice diversa si dovrà usare una retta di calibrazione differente da cui si ricava il valore esatto della concentrazione, se si usa la stessa retta di quella dell’acqua distillata la concentrazione rilevata è scorretta e si ha errore sistematico, quindi una accuratezza minore.

→ Errore grossolano: errori che statisticamente non vengono considerati, sono causati dalla inaccuratezza dell’operatore, calcoli o manualità.

Se gli errori random agiscono in direzione imprevedibile sia in eccesso che in difetto, quello che si ottiene è una distribuzione descritta in termini di densità di probabilità da una gaussiana, cioè una curva continua che non ammette come soluzione un integrale definito, ma deve essere calcolato numericamente cioè per elementi finiti. L’integrale calcolato numericamente è la sommatoria delle aree per un determinato numero Δx lim(Δx) → 0, la soluzione dell’integrale è migliore quando intervallo Δx è piccolo. In assenza di errore sistematico, si confonde la funzione continua con il sistema discreto ottenuto da n replicati al quale si può calcolare un valore medio, determinando la deviazione standard. La gaussiana è definita curva normale di distribuzione, perché è quello che accade nel caso in cui gli errori sistematici agiscono in difetto o in eccesso. Non tutti gli strumenti producono una curva normale di distribuzione, perché per n replicati si usano diversi strumenti si possono ottenere curve simili alla gaussiana oppure curve distorte, in base a come agiscono gli errori casuali.

Sigma è la deviazione standard calcolata su una curva continua, è circa S quando si ha un numero sufficientemente elevato di replicati (>20) e il valore è affidabile. Se è <20 allora si determina S, cioè la stima di sigma.

Come valutare numericamente la precisione e accuratezza di un metodo

Si sfrutta la curva normale di distribuzione, perché basta fare n analisi replicate di un qualsiasi campione, non per forza standard, e si calcola la deviazione standard determinando il livello di confidenza. Se uno strumento o un protocollo analitico distribuisce i replicati secondo una curva normale di distribuzione è noto che l’integrale trovato tra -σ e +σ vale 68.2% che è l’area sottesa dalla gaussiana, se tra -2σ e +2σ vale 95% e se tra -3σ e +3σ vale 99%. In termini di probabilità queste percentuali significano che se si esegue un altro replicato si avrà il 68.2% che il suo valore sia tra -σ e +σ, il 95% tra -2σ e +2σ e il 99% tra -3σ e +3σ. Z score è un valore frazionario che si mette davanti a sigma per stabilire il livello di copertura, cioè l’area della gaussiana di interesse, Z è tabulato e si può scegliere il suo valore in base all’area.

La curva normale di distribuzione permette di determinare il valore di accuratezza ma solo se si hanno standard certificati. Bisogna vedere se la media delle analisi replicate coincide con il valore noto e determinare quanto si discosta dal valore vero. La deviazione standard si riferisce al livello di probabilità che ha il singolo replicato di cadere in un certo intervallo, perciò il valore di deviazione standard si applica solo al valore del singolo replicato, quindi è una misura della precisione da applicare al singolo. Se si eseguono n analisi e si fa la media, ci si deve aspettare che la precisione che si assegna alla media è migliore della precisione che si assegna al singolo, quindi la media è più affidabile del singolo cioè è più precisa, di quanto? di √ che rappresenta il numero di replicati eseguiti. Quando N è grande la deviazione tende ad essere molto piccola, quindi la precisione può essere migliorata aumentando il numero di replicati, ma ovviamente c’è un limite pratico. = = ̄ ± Deviazione standard della media: è molto più precisa della media di un singolo replicato. ̄ √ √

Legge di propagazione degli errori

√ Da dove arriva?

Per determinare il livello di precisione che possiede la media di N replicati, cioè per capire se c’è un problema di accuratezza bisogna analizzare N replicati di uno standard a concentrazione nota. Dopo aver stabilito il valore medio e l’impatto dell’errore casuale attraverso la stima dell’errore casuale che si può allargare o restringere in funzione di Z, si confronta il valore medio con il valore vero. Se il valore vero ricade all’interno di ̄ ± per un valore di confidenza stabilito, 95% quindi Z=2, √ allora non c’è uno scostamento significativo tra il valore vero e la media degli N replicati. Quindi se non c’è un problema di accuratezza, l’ipotesi è nulla cioè non c’è un bias, errore sistematico. Se c’è un problema di accuratezza allora l’ipotesi non è verificata e la differenza tra valore medio e valore vero è significativa.

Il valore medio è tanto più preciso quanto è alto il numero di replicati, quindi si può avere una precisione estremamente piccola, perciò il dato può essere infinitamente preciso. La gaussiana si restringe all’aumentare di N. Se il valore vero cade nella gaussiana allora non sono stato in grado di provare l’esistenza di un bias, se invece N è molto grande, la campana si stringe perché la deviazione è molto piccola e quindi la presenza di bias può essere provata, in quanto il valore vero è fuori dalla gaussiana, il valore medio può cambiare.

Test t di student

Test statistico per verificare se il valore medio di una distribuzione si discosta significativamente dal valore medio quando si ha N<20, quindi si ha solo una stima di sigma, cioè s. Ideato da Steve Gossep e calcolato con ̄ ± con t che ha lo stesso significato di Z ma dipende sia dall’intervallo di confidenza che dal numero di √ replicati usati per determinare la deviazione standard, quindi si considera come gradi di libertà N-1 perché 1 è perso per determinare la media. Quando N tende a infinito si ha che t è 1.960 come il livello di confidenza che si ha per Z al 95%. Se il valore medio è significativamente superiore o minore della media si ha campana a una coda, inoltre si possono avere anche curve asimmetriche.

Metodo di calibrazione

Metodi univariati dove un segnale è correlato a una concentrazione, quindi correlazione diretta ed esplicita tra segnale e concentrazione. Si possono classificare in 3 categorie in base al campo di applicazione:

• → Curva di calibrazione, calibrazioni esterne: preparazione di standard a concentrazione nota e si leggono allo strumento il segnale corrispondente alla concentrazione, ottenendo in un grafico la curva da cui si estrapola graficamente la concentrazione del campione incognito oppure si può ricavare matematicamente conoscendo l’equazione della retta e R². Se la retta non parte da zero, ad assorbanze molto basse si ottengono concentrazioni negative e non ha senso, quindi l’approssimazione lineare è sbagliata e lo si nota attraverso il grafico dei residui, per ogni valore di x dello standard si considera la differenza tra il dato sperimentale e quello ottenuto dalla retta, quindi esprime il discostamento dall’andamento lineare. Se la retta parte da zero, il grafico dei residui ha valori molto piccoli compresi in un intervallo molto basso vicino a 0. Nel caso di curve, queste vengono scomposte in diversi tratti in cui si usa una calibrazione lineare.

Metodi dei minimi quadrati: sono noti con assoluta precisione i valori delle concentrazioni, asse x, e incerti i valori di y che è la misura sperimentale, quindi cerca la migliore retta che minimizzi la distanza di tutti i valori di y nei confronti della retta stessa.

Problema principale: l’andamento rettilineo lineare non è infinito.

Situazione tipica che si presenta con una calibrazione strumentale per cui si ha un range dinamico che è la parte di risposta di correlazione lineare tra segnale e concentrazione. A un certo punto il segnale non è più lineare ad esempio il detector è arrivato alla sua massima capacità di conteggio o il rumore strumentale inizia a essere rivelante, questo è il comportamento che si osserva nella maggior parte dei casi e viene descritto da una polinomiale di secondo grado. In alcuni casi ci potrebbero essere curve di taratura con due range distinti che sono descritti da due approssimazioni lineari, cioè la la curva viene descritta da due rette.

• → Metodo aggiunte standard usato in alternativa alla calibrazione esterna. Il segnale dell’analita non si legge su una retta di calibrazione ma su una retta generata dallo stesso analita a cui si aggiungono aliquote crescenti. Si usa quando la matrice è complessa e non riproducibile. La concentrazione è ottenuta per y=0 ma cambiata di segno. Sull’asse delle x bisogna mettere la concentrazione aggiunta all’analita. Bisogna stare attenti a come si programmano le aggiunte. Un errore nella stima della pendenza si ha quando vengono fatte aggiunte troppo piccole rispetto al valore previsto, inoltre se l’errore casuale è costante per tutte le concentrazioni allora si possono fare aggiunte anche molto elevate per migliorare la determinazione della pendenza. Non si può usare con una curva di calibrazione quadratica perché una curva di calibrazione deve avere punti in 3 zone distinte e nel caso del metodo delle aggiunte non si hanno, tutti i punti al di sotto della concentrazione 0 non ci sono, le 3 zone sono: parte terminale sx, parte centrale e parte terminale dx, sono fondamentali per modellare la curvatura se mancano punti in questa zona allora la curva non è descritta correttamente e ci sarà una forte incertezza nella definizione del grado di curvatura.

Metodo che determina una concentrazione in una zona di estrapolazione partendo dalla retta di calibrazione, considerando tutti quei segnali che cadono nella regione di interpolazione, perché attraverso gli standard si è studiato come si comporta il protocollo analitico. Oltre al massimo osservato ho una regione di estrapolazione in cui assumo che quel punto si comporti come nella zona di interpolazione ma potrebbero esserci errori in quanto dopo quel massimo la retta potrebbe curvarsi.

Problemi: pone q uguale a 0 e potrebbe non esserlo a causa della soluzione se non è perfettamente limpida oppure le cuvette sono sporche mentre il secondo problema è dovuto alla presenza di interferenti fa sì che il segnale non sale a concentrazioni basse quindi si ha intercetta negativa, gli interferenti infatti recidono il segnale in un determinato intervallo. Carico lavoro eccessivo per l’operatore.

• → Standard interno si aggiunge al campione una quantità di una sostanza differente da quella da determinare e analizzare contemporaneamente il segnale che viene fornito dall’analita e dalla sostanza aggiunta. Si usa con alcuni metodi strumentali che hanno una risposta che varia da campione a campione per diversi motivi e di conseguenza fare una retta di calibrazione esterna da cui ricavare la concentrazione dell’analita è un problema in quanto potrebbero esserci dei fattori che influenzano la risposta ed è difficile avere una precisa determinazione. La presenza dello standard interno che ha uguale comportamento dell’analita si può capire la variabilità del metodo.

Esempio: iniezioni cromatografiche svolte manualmente porta a un errore casuale per ogni campione. Quando la concentrazione di analita e di standard interno è lo stesso e viene iniettato si hanno due valori di aree, segnale*tempo, diverse perché sostanze diverse danno risposte diverse al detector dello strumento. Si calcola fattore di risposta, o correzione, = . Se le concentrazioni di analita e di standard interno sono diverse allora sì deve normalizzare la risposta e si calcola il fattore di risposta è ∙ . Il metodo dello standard interno compensa pienamente l’imprecisione nell’iniezione all’interno di un sistema cromatografico.

Selettività

= + + → Un metodo è tanto più selettivo nei confronti dell’analita rispetto alla specie interferente quanto più m > m . A B

Il coefficiente di selettività è il rapporto tra le due sensibilità, cioè tra i due coefficienti angolari del metodo e più è basso più è selettivo il metodo. con m che è la pendenza della curva di calibrazione:, = /

• = 0 → Il metodo è selettivo,
• < 0 → I segni di m e m sono discordi cioè la presenza di B causa una diminuzione del segnale generato e quindi l&rsqu