Appunti Biotecnologie della riproduzione assistita

Biotecnologie della riproduzione assistita - 6 CFU

Programma del corso

• Gametogenesi umana: spermatogenesi e ovogenesi (6 ore)
• Valutazione del liquido seminale, tecniche di separazione nemaspermica ed inseminazione intrauterina (5 ore)
• Fecondazione assistita: stimolazione ovarica, prelievo chirurgico di ovociti e spermatozoi, inseminazione in vitro (FIVET e ICSI), trasferimento embrionale (6 ore)
• Valutazione di ovociti ed embrioni pre-impianto (5 ore)
• Tecniche di crioconservazione di gameti ed embrioni (5 ore)
• Risultati delle tecniche di procreazione medicalmente assistita ed il loro impatto sociale (5 ore)
• Diagnosi genetica pre-impianto (6 ore)
• Cenni sulla gestione qualità dei centri di PMA ed inquadramento legislativo (4 ore)

Libro consigliato: Biologie della riproduzione umana. Lenzi e Gandini

Lezione 1

Il concepire un bambino garantisce la sopravvivenza della specie, è un’esperienza importante della vita. “L’infertilità è una patologia caratterizzata dall’incapacità di generare una gravidanza dopo 12 mesi di regolari rapporti sessuali non protetti dovuti ad una incapacità riproduttiva del singolo partner o del/della partner.” Questa è la definizione dell’OMS.

Questa definizione si estende anche a coppie di individui dello stesso sesso, individui single e anche persone che hanno avuto un cancro e di conseguenza hanno subito trattamenti oncologici (gonadotossici). Si possono conservare le uova o gli spermatozoi e di conseguenza l’infertilità può essere bypassata attraverso le cure fornite dal SSN. A tutti questi individui è rivolta la procreazione medicalmente assistita. L’infertilità è considerata come una patologia che genera disabilità: ci sono oltre 50 milioni di coppie in tutto il mondo colpite da infertilità per svariati motivi, che vedremo in seguito.

Dagli anni '60 ad oggi c’è una drammatica riduzione del numero di bambini per donna fertile, oggi si è scesi sotto a 2, prima erano almeno 3. Inoltre, la gravidanza viene sempre più posticipata. Tutto ciò non è specifico di una sola regione, ma è diffuso ovunque in tutto il mondo tranne nell’Africa Sub-Sahariana. Il numero di figli è inversamente proporzionale al reddito: più si hanno soldi meno figli si vogliono; il figlio viene percepito come un costo mentre prima erano ulteriori braccia per il lavoro. La Francia non ha avuto lo stesso calo di nascite dell’Italia perché sono stati investiti moltissimi soldi per la genitorialità, sgravi fiscali e altri contributi. Si tratta di un progetto a medio-lungo termine perché i benefici si avranno in futuro.

Il fact-book è un report che mostra varie tendenze in tutto il mondo. Nel nostro caso si vede che la popolazione europea sta invecchiando, nel 2025 si arriverà a 49-50 anni di età media. Ci sarà un aumento di tasse e serviranno misure specifiche e politiche atte ad affrontare questo declino demografico. Tramite questi grafici della CIA si è stimato che per l’Italia e il Giappone si arriverà ad una tassazione del 50-60%. In questo contesto si vede l’importanza delle tecniche di biologia riproduttiva, nate 50 anni fa.

Fecondazione assistita

Prendiamo le uova da una donna che ha subito una stimolazione per produrne molte, le inseriamo in una piastra Petri insieme agli spermatozoi e poi si reimpianta l’embrione in utero. La prima bambina concepita in questo modo ha oggi 40 anni. Le prime fecondazioni assistite hanno creato molte controversie perché non si sapeva se stare fuori dall’utero poteva creare problemi al feto. Oggi l’età media è 32,1 per la prima gravidanza e quindi sono aumentate le problematiche non l’infertilità. In passato, a quest’età una donna era considerata una primipara attempata.

La PMA svolge un ruolo cruciale per la riproduzione assistita: si è passati da 1 su 10, a 2,4% di bambini nati per procreazione assistita. Ci sono vari pensieri errati diffusi sulla fecondazione assistita:

• Paura delle stimolazioni ormonali
• Nascita di gemelli
• Inefficacia

Si è visto che con l’aumentare dell’età queste tecniche di PMA perdono la loro efficacia o se funzionano c’è un’alta probabilità di aborto. 2/3 della popolazione che si rivolge alla PMA ha più di 35 anni. La correlazione tra l’aumentare dell’età e la diminuzione dell’efficacia delle tecniche di PMA e della capacità in generale di rimanere incinte dipende dalla meiosi nella donna che è molto delicata.

Meiosi

Meiosi I: si dividono i due cromosomi omologhi della madre e del padre: aploide.

Meiosi II: si dividono i 4 cromatidi fratelli. La cosa importante è il crossing-over che garantisce la ricombinazione genetica, non solo perché vengono ricombinati i geni del padre e della madre ma anche per lo scambio dei “pezzettini” dei cromatidi. Se la meiosi fosse solo quella rappresentata nella parte A, 1 individuo su 5 non verrebbe generato. Esistono tanti modi diversi per avere una meiosi corretta perché si generano degli errori che poi vengono riparati attraverso sistemi appositi.

- La meiosi femminile è molto speciale e unica perché inizia in età fetale: al quarto mese di gravidanza mi vengono date le uova da mia madre e queste si bloccano mentre stanno facendo il crossing-over in modo tale che i cromosomi omologhi rimangano uniti fino a quando non servono le proteine che uniscono i cromosomi omologhi sono le coesine. Quindi possiamo dire che la profase I duri anni, poi nel momento opportuno riprende e si ferma di nuovo alla metafase per poi completarsi nel momento in cui l’uovo incontra lo spermatozoo. Con l’avanzare dell’età invece i cromosomi omologhi perdono la loro coesione e aumenta la capacità di errore.

- La meiosi maschile invece è molto semplice e consta di due fasi: I e II.

Pubblicazione su Science: Curva a U mette in relazione l’età con la fertilità.

Genetica: tramite le tecniche genetiche si riesce a quantificare quanto incide il patrimonio paterno e quello materno. Si è visto che più sono i siti di crossing-over, migliore è la qualità dell’uovo. Le prime fasi di sviluppo embrionale sono le più delicate perché se avvengono errori in queste fasi, questi riguarderanno tutte le cellule.

La fecondazione assistita non può correggere la qualità intrinseca dell’uovo o spermatozoo ma piuttosto elimina le barriere meccaniche (ad es. non possiamo eliminare una trisomia). Siccome la qualità dell’uovo non può essere corretta allora prendo l’uovo di una donatrice: es. caso di una donna di 50 anni. Ad oggi le donne di 50 anni possono accedere alla fecondazione eterologa usando appunto le uova di una donatrice.

Laboratorio di fecondazione assistita

Ha le sembianze di una sala operatoria.

Spermatogenesi

La spermatogenesi è il processo di formazione e maturazione delle cellule germinali maschili in spermatozoi.

• Fase mitotica: moltiplicazione degli spermatogoni per avere un pool sempre uguale dalla pubertà fino alla fine della vita (cellule staminali germinali). Dura circa 16 giorni. Lo spermatogonio diventa spermatocita primario.
• Fase meiotica: divisione meiotica degli spermatociti I. 2 fasi: la prima dura 24 giorni e vede la trasformazione dello spermatocita primario in secondario e la seconda dura qualche ora si formano gli spermatidi.
• Spermiogenesi: trasformazione morfologica degli spermatidi in spermatozoi per oltrepassare le barriere degli apparati sessuali. Dura 24 giorni si ottengono spermatozoi maturi.

Nell’uomo ha una durata di 64 +/- 4 giorni e permette la produzione di circa 120 milioni di spermatozoi al giorno. Processo veloce ed efficace.

Il tubulo seminifero ha una morfologia che rispecchia perfettamente la funzione che svolge, infatti se lo si osserva dall’esterno verso l’interno si possono osservare i vari stadi di maturazione delle cellule, trovando nella parte centrale gli spermatozoi maturi (nel lume). Gli spermatozoi entrano nel lume, lo attraversano tutto e arrivano al testicolo che è un groviglio di tubuli seminiferi che poi portano gli spermatozoi lungo l’epididimo e fuori dall’apparato genitale maschile.

Andando ad esaminare più dettagliatamente le cellule che compongono il lume troviamo:

• Cellule germinali primordiali: spermatogoni che si dividono in due tramite mitosi, uno serve per ripopolare il testicolo, l’altro per proseguire il processo di maturazione.
• Il secondo, tramite maturazione diventa spermatocita primario
• Lo spermatocita primario tramite la prima divisione meiotica produce due spermatociti secondari bicromatidici
• Gli spermatociti secondari attraverso la seconda divisione meiotica diventano quattro spermatidi aploidi
• Gli spermatidi si devono poi trasformare assumendo la loro caratteristica forma (testa + flagello) per essere in grado di trasportare il materiale genetico.

Fase mitotica 8-10 giorni

Esistono delle nicchie seminali: presenza di cellule staminali, alta vascolarizzazione, cellule di Leydig. Gli spermatogoni si dividono in Spermatogonio A e B. La spermatogenesi lavora in onde. Gli spermatogoni lavorano in sincizi. Quando lo spermatocita primario decide di entrare nella fase maturativa, durante le mitosi esistono delle continuità citoplasmatiche cioè due spermatogoni si replicano in 4 che presentano 4 nuclei con i 4 citoplasmi in contatto: questo permette la sincronizzazione della formazione degli spermatozoi, infatti anche le cellule che entrano nella meiosi sono sincrone e funzionano insieme. Formazione onde che producono molti spermatozoi tutti maturi nello stesso momento. Dopo la seconda meiosi si formano gli spermatidi che maturando perdono poi il rivestimento citoplasmatico che li appesantirebbe nel loro cammino.

Fase II meiosi

La meiosi consta di 3 diverse fasi e da 1 cellula se ne ottengono 4:

• Duplicazione del DNA: il DNA si duplica e forma i cromosomi formati dai 2 cromatidi uniti dal centromero
• I divisione meiotica: noi umani abbiamo 23 coppie di cromosomi (uno di origine paterna e uno materna), si chiamano cromosomi omologhi. I cromosomi omologhi si allineano sulla piastra metafasica cioè al centro della cellula e verranno trascinati dai microtubuli per poi separarsi e andare in 2 spermatociti secondari. Durante questo allineamento avviene il crossing over.
• II divisione meiotica: gli spermatociti secondari hanno un corredo cromosomico aploide: 23 cromosomi formati da 2 cromatidi quindi serve una seconda divisione equazionale che separi i cromatidi fratelli e alla fine abbiamo spermatidi aploidi con un solo cromatide.

Fase III spermiogenesi e struttura spermatozoo

Uno spermatide con nucleo e citoplasma svilupperà vari accessori. Da una parte si forma l’acrosoma dall’apparato del Golgi (cappuccio enzimatico che permette l’attraversamento della barriera dell’ovocita), dall’altra parte si ha perdita del citoplasma con relativa fagocitosi e sviluppo del flagello. Nel collo sono presenti le riserve energetiche rappresentate dai mitocondri che permetteranno il movimento insieme al flagello. Nella testa è presente un nucleo molto compattato nella compattazione del DNA vengono eliminati gli istoni e si usano altre proteine (protamine). È presente anche un centriolo prossimale fondamentale per la fecondazione perché nell’ovocita vengono portati solo il DNA e il centriolo.

Flagello: struttura molto complessa con assonema 9+2: si trovano 9 coppie di microtubuli esterne + 2 centrali, è lo slittamento di queste due centrali a permettere il movimento.

Un errore nella corretta configurazione cromosomica potrebbe creare spermatidi errati (diploidia, monosomia…). Questi errori sono rari e più comuni nella meiosi femminile. Configurazione normale: 18X.

Nel testicolo oltre alle cellule germinali esistono anche delle cellule somatiche di 2 tipi:

• Nel tubulo seminifero abbiamo le cellule del Sertoli fondamentali a sostenere la spermatogenesi. Si trovano nel connettivo. Servono per dare sostegno alle cellule germinali dall’esterno verso l’interno e sono inoltre responsabili del mantenimento del numero degli spermatogoni che sono le cellule germinali, mantenendo così l’omeostasi. Queste cellule producono anche ormoni sotto stimolazione dell’ormone FSH prodotto dall’adenoipofisi. Le cellule del Sertoli presentano dei recettori specifici per l’FSH. Durante la vita fetale producono anche l’ormone anti-Mulleriano AMH in tal modo concorrono alla degenerazione del dotto di Muller e alla differenziazione in senso maschile delle gonadi indifferenziate. Dopo la pubertà le cellule del Sertoli producono anche gli ormoni inibina e attivina. Secernono anche proteine leganti gli androgeni ABP che hanno un fattore neutrofico delle cellule derivate dalla linea gliale, che è stato dimostrato abbiano un effetto proliferativo sugli spermatogoni indifferenziati. Producono anche fattori di trascrizione e producono la cosiddetta barriera ematotesticolare. Contribuiscono anche alla rimozione dell’eccesso di citoplasma dagli spermatidi maturi. Secernono anche il fluido che permette il viaggio nel lume.
• Tra un tubulo seminifero e un altro ci sono le cellule di Leydig, nello stroma. Rilasciano principalmente ormoni androgeni come il testosterone e l’androstenedione. Le cellule di Leydig sono stimolate dall’ormone luteinizzante LH ipofisario. Il testosterone è fondamentale allo sviluppo degli organi sessuali, al differenziamento del testicolo e per i caratteri sessuali secondari. Questo ormone in età puberale limita anche l’accrescimento delle ossa lunghe evitando una crescita sproporzionata. Nell’uomo adulto i livelli di testosterone giocano un ruolo fondamentale per la sessualità, l’apparato muscolare scheletrico, la buona salute e la vitalità, contribuisce quindi a mantenere la fertilità perché contribuisce alla maturazione degli spermatozoi nel testicolo. Inoltre, influenza qualità e quantità dello sperma prodotto poiché opera sulle vie seminali e sulla prostata deputate alla produzione di sperma. L’ormone FSH aumenta la risposta delle cellule di Leydig all’LH.

Asse ipotalamo-ipofisi-gonadi

Importantissimo nell’ovogenesi e nella spermatogenesi. Sotto lo stimolo dell’ipotalamo, l’ipofisi produce due ormoni che sono l’LH (luteinizzante) e l’FSH (follicolo stimolante) che contribuiscono entrambi a stimolare la spermatogenesi. L’LH va a stimolare direttamente le cellule del Leydig che producono testosterone che va nel compartimento interno del tubulo seminifero a stimolare le cellule del Sertoli. L’FSH va direttamente a stimolare le cellule del Sertoli che possiedono i recettori specifici, in esse il testosterone che è arrivato viene trasformato in diidrotestosterone ed estradiolo. Questi 2 ormoni viaggiano attraverso il sangue per arrivare poi all’ipotalamo creando un feedback negativo alla produzione di FSH. Anche l’inibina svolge un feedback negativo. La prima fase della meiosi è ormone indipendente, la seconda dipendente.

Barriera emato-testicolare

Presente nei tubuli seminiferi e formata dalle cellule del Sertoli. Presenta giunzioni occludenti e impedisce il passaggio di molecole tra il compartimento basale e quello adluminare. Questo è fondamentale perché gli spermatozoi vengono prodotti in pubertà e quindi si evita la produzione di anticorpi anti-spermatozoi.

Maturazione degli spermatozoi nelle vie seminali

Per poter uscire dall’apparato maschile gli spermatozoi seguono un complesso sistema di canali che comincia con l’epididimo che è situato postero-lateralmente ad ogni testicolo. È formato da una testa molto voluminosa, da un corpo e da una coda che si continua con il dotto deferente. Dopo che lo spermatozoo ha avuto la sua maturazione morfologica completa il processo con un’ulteriore maturazione (acquisizione mobilità) nell’epididimo. Nell’apparato genitale femminile avviene invece la capacitazione perché lo spermatozoo si troverà ad una temperatura più alta e quindi tramite la reazione acrosomiale si attiverà e potrà fecondare. Il dotto deferente è lungo circa 30 cm e funge da raccolta di spermatozoi maturi. Esistono poi le vescicole o vescichette seminali che producono liquido seminale.

Nella meiosi sono coinvolti vari geni che se subissero mutazioni comprometterebbero la spermatogenesi.

Principali geni coinvolti nella spermatogenesi

• Gene che codifica per il recettore degli androgeni: per una normale spermatogenesi ci sono i geni che codificano per i recettori per gli androgeni che se subiscono mutazioni possono generare una sindrome molto particolare che si chiama sex reverse: non essendoci i recettori per gli androgeni è come se non ci fossero androgeni e quindi il fenotipo della persona è femminile malgrado il cariotipo sia XY maschile.
• Geni che veicolano la sostituzione degli istoni in protamine: garantiscono l’impacchettamento della testa dello spermatozoo.
• Geni coinvolti nella formazione dell’acrosoma: Gene SPATA coinvolto in una sindrome che porta ad una totale infertilità: Globozoospermia = totale assenza di acrosoma con teste rotonde.

Sul cromosoma Y sono stati identificati locus responsabili della spermatogenesi, in particolare l’AZF: se ci fosse una mutazione o una delezione in questa zona ci sarebbe un alto rischio che i pazienti siano azoospermici.