Appunti Bioingegneria chimica Parte 2

Bioingegneria chimica

Prof Petrini e Mantero, 2019/2020

Di Gabriele Santicchi

Sommario

• Biocompatibilità ........................................................................................................................................................................... 2
• Valutazione risposta biologica del materiale ......................................................................................................................... 3
• 1. Test in vitro (Test cellulari) ..................................................................................................................................................... 3
• 2. Test in vivo (Impianti in modello animale) ............................................................................................................................... 4
• Processo infiammatorio ............................................................................................................................................................. 6
• Infiammazione acuta ............................................................................................................................................................... 6
• Infiammazione cronica............................................................................................................................................................ 7
• Sistema immunitario .................................................................................................................................................................... 8
• Immunità naturale (Non specifica-congenita) ........................................................................................................................... 8
• Immunità acquisita (Adattativa, specifica) ................................................................................................................................. 8
• Immunità umorale (Linfociti B - AC) ......................................................................................................................................... 8
• Immunità cellulo mediata (Linfociti T) ....................................................................................................................................... 8
• Sistema linfatico ....................................................................................................................................................................... 8
• Antigeni ...................................................................................................................................................................................... 8
• Anticorpi .................................................................................................................................................................................... 9
• Il sistema del complemento (SC) ................................................................................................................................................ 9
• Sistema emostatico .................................................................................................................................................................... 10
• Coagulazione .............................................................................................................................................................................. 10
• Percorso intrinseco: .................................................................................................................................................................. 10
• Percorso estrinseco: .................................................................................................................................................................. 10
• Processo di fibrinolisi .................................................................................................................................................................. 10
• Adsorbimento proteico ......................................................................................................................................................... 11
• Proteine ....................................................................................................................................................................................... 11
• La cellula ..................................................................................................................................................................................... 13
• Tessuto connettivo .................................................................................................................................................................... 14
• Endocitosi ............................................................................................................................................................................... 14
• Chemiotassi .............................................................................................................................................................................. 15
• Mastociti. ................................................................................................................................................................................. 15
• Macrofagi .............................................................................................................................................................................. 15
• Fibroblasti ............................................................................................................................................................................... 15
• Sangue ...................................................................................................................................................................................... 16
• Cellule endoteliali ................................................................................................................................................................. 16
• Angiogenesi............................................................................................................................................................................. 16
• Protesi vascolari ........................................................................................................................................................................ 17
• Protesi d’anca.............................................................................................................................................................................. 18
• Protesi cardiache ....................................................................................................................................................................... 21
• Decellularizzazione ................................................................................................................................................................... 23
• Biomateriali ................................................................................................................................................................................. 24
• Clonazione ............................................................................................................................................................................... 24

1- Bioingegneria Chimica Gabriele Santicchi 2019/2020

Biocompatibilità

capacità del materiale di generare una risposta appropriata in un sistema ospitante, data una determinata applicazione. Analisi della biocompatibilità di tutti i dispositivi all'interno di un organismo vivente

Nostro organismo accoglie solo mat. autologhi (cellule del paziente stesso);

Se non autologo e non vivente --> Formazione strato fibroso -> Rimozione corpo estraneo (es. protesi)

Se non autologo e vivente -> Eliminazione/Rigetto ogg (Ciclosporine: Evita rigetto cell di corpo ext)

Rigetto: Chiusura tutti vasi che portano all'organo -> Apoptosi cell ext.

Rigetto è fenomeno in seguito a riconoscimento estraneo complesso di istocompatibilità

Reazione immunitaria: Rigetto

Reazione infiammatoria: Reazione al corpo estraneo

Non sono scollegate tra di loro; intervengono entrambi quando arriva segnale, poi viene riconosciuto il materiale --> prevale 1 reazione tra le due a sec del tipo di mat

Definizioni

Biocompatibilità dei dispositivi: abilità del dispositivo di svolgere la sua specifica funzione, con il desiderato grado di incorporazione nel tessuto ospite, senza provocare alcun effetto locale o sistemico indesiderato in tale tessuto. I sistemi che generano un effetto sistemico sono il sangue, il sistema linfatico,...

Biocompatibilità degli scaffold: abilità del supporto di comportarsi come substrato in grado di supportare l'appropriata attività cellulare, includendo la facilitazione di sistemi di segnali molecolari e meccanici in modo da ottimizzare la rigenerazione dei tessuti, senza provocare alcun effetto locale o sistemico indesiderato sull'ospite.

Biosicurezza: esclusione di possibili danni seri causati dal materiale a carico dell'organismo ospite.

Biofunzionalità: capacità del materiale di stimolare nell'ospite la risposta desiderata per la specifica applicazione.

Biomateriali

Suddivisione in artificiali (polimeri, ceramici, metalli) e naturali (viventi e non)

• Materiali artificiali sintetici si dividono in 3 categorie:
• 1) Metalli: >> proprietà meccanica, ma si corrodono! <-> necessario ridurre corrosione (liberazione di ioni)
• 2) Polimeri: sono a base di C; max compatibilità. Non si corrodono ma degradano -> <peso molec. -> <<prop meccaniche
• 3) Ceramici: duri, inerti, fragili -> no adatti a zone soggette a urto. Resist >> a compressione -> adatte ad es. x valv cardiache
• Materiali naturali da paziente stesso o corpo/animale altrui. Viventi (Organi) e non viventi (Cellule)
• 1) Autograft: Materiale ottenuto da paziente stesso (max compatibilità).

Tuttavia trapianto termine utilizzato per tessuti organi non del paziente stesso.. Tessuto è composto da cellule + ECM; È possibile rimuovere componente cellulare; prestazioni meccaniche non alterate! <-> sono influenzate dalla matrice

• 2) Homograft Organo/tessuto senza cellule, prelevati da umano -> no problema rigetto
• 3) Eterograft Prelevati da animale; reazioni compatibili a mat polimerici

Biocompatibilità protesi: 3 classi

Tipo compatibilità/dipende da.. ? Forma/Peso/ Materiale

Anatomica (Considera forma, geometria, densità..) Sì all'80% Sì al 20%

Funzionale (Dispositivo ripristina e quanto la funzione orig persa? È autonomo o Sì al 10% Sì al 90%! Bisogna supporti farmacologici? Per quanto tempo mantiene la funzione?) considerare le prop meccaniche di esso!

Biologica (Dipende dall'interfaccia; tessuto più difficile da controllare è sangue, Sì al 20% Sì al 80% perché coagula con qualsiasi mat. tranne endotelio)

2- Bioingegneria Chimica Gabriele Santicchi 2019/2020

Interazione biomateriale-corpo umano

A: Effetto dell'impianto sull'ospite

cosa può provocare il dispositivo all’ospite?

• Carcinogenesi. Il dispositivo provoca tumore. Questo effetto è remoto, in una curva di probabilità è al minimo
• Infezione: (!= da infiammazione! Fenomeni != ). Reazione con sistema immunitario perché sono entrati nel corpo batteri o virus non desiderati (causa esogena). È una manchevolezza durante l'intervento chirurgico.
• Infiammazione: O per ingiuria chirurgica o per i continui movimenti tra i dispositivo e ospite. Presente quando ci sono virus e batteri estranei ma anche in presenza di lacerazioni, in presenza di materiali estranei -> Obiettivo: distruzione di agenti estranei. Se sono batteri -> interviene anche reazione immunitaria
• Cito e emotossicità: Da evitare; non esiste alcun materiale emocompatibile al 100%, perché è tessuto critico (e coagula)
• Sensibilizzazione allergica, tossicità sistemica e reazioni immunitarie. L'impianto genera una situazione catastrofica.
• Formazione di emboli: coagulo che si è formato nella protesi che non è sta attaccato alla protesi ma parte seguendo il flusso di sangue. -> si blocca in vaso arterioso con diam simile -> può provocare infarto (se nel cuore) ictus (nel cervello), necrosi (arto/org)

B: Effetto dell'ospite sull'impianto

• Usura. Causa: scorrimento relativo -> produz frammenti (=corpi estranei) -> Processo infiammatorio
• Fatica meccanica: rottura in seguito a numero elevato di cicli. In più l'organismo umano butta fuori enzimi lisosomiali molto acidi e aggressivi che possono fessurare il materiale. Le sue sezioni locali diminuiscono tutte.
• Ossidazione, fessurazione superficiale.
• Environmental stress cracking. Ho mat dentro un ambiente aggressivo che subisce degli sforzi. Effetto chim/meccanico
• Assorbimento del materiale dai tessuti, degradazione enzimatica
• Calcificazione dei materiali, soprattutto a contatto con il sangue mat subiscono fenomeni di calcificazione. Subiscono processi di calcificazione i materiali naturali. Il metallo non calcifica, un homograft può calcificare.

Il primo evento che avviene a seguito dell'impianto: superficie rivestita da uno strato proteico: avviene adsorbimento di proteine e tutti gli eventi successivi dipendono da che proteine sono adsorbite sul materiale (coagulazione avviene se adsobite prot della coagulaz!) -> Meglio rivestire prima mat con prot volute per evitare problema.

Valutazione risposta biologica del materiale

Le 2 categorie di test (in vitro e in vivo) seguono normativa ISO 10993; essa descrive i 18 test da effettuare per valutare la compatibilità (indicazioni operative molto precise (tempi, quantità..)

1. Test in vitro (Test cellulari)

2 tipi di test:

1.1 Citotossicità nei confronti di cellule in vitro; analisi della variazione della loro normale funzionalità.

Test indiretto: come le cell reagiscono ai prodotti di degradaz del materiale. Si pone materiale su vetrino e liquido medium (fisiologico) a contatto con il mat; se il mat rilascia sostanze, esse finiscono nel M; Prendo il M e ci coltivo le cellule su vaschetta nuova; le faccio crescere: se mat ha rilasciato sost tossiche -> Morte cell; altrimento no differenze con cell iniziali

Test diretto: mat in esame messo nella piastrina con le cellule e M. Si valuta contatto tra cell-mat; mat solitamente rilascia ioni metallici (se tanti -> pericolo). Residui: ingeriti da macrofagi -> inglobano partic all’int della cell. Analisi tossicità diretta, osservando adesione, proliferazione, secrezione cellulare adeguata.

Come faccio a capire se le cellule sono vive o morte? Metodi quantitativi (utilizzano analisi colorimetriche).

• Test MTT: Nella coltura cell viene utilizzata sost (MTT) che si lega all'int delle cell vive -> Permette di visualizzare distribuz cellule osservando quantità di formazano (cioè il prodotto) proporzionale alle cell vive. (Met qualitativo)
• Alamar Blue: I nuclei delle cellule vive sono blu, quelli delle cellule morte sono viola. (Metodo qualitativo: Guardo se prevale blu o viola)

Vedere esempi sperimentali su slide capacità di causare anomalie

1.2 Mutagenicità / Carcinogenicità: genetiche tramite contatto diretto o indiretto con il materiale o con sostanze da esso rilasciate.

Saggio di Ames: rilevazione di mutazioni delle funzioni metaboliche dei batteri.

1.3 Citocompatibilità con specifico tessuto bio

3- Bioingegneria Chimica Gabriele Santicchi 2019/2020

Cellule da utilizzare

Ma quali tipo di cellule da utilizzare?

Cellule: In grado di vivere in amb artificiale se trattate adeguatamente; anche organi, ma tessuti no (Richiedono >>perfusione).

Due tipi di cell:

a) Primarie: Isolate (espiantate) da paziente/organismo specifico; tuttavia nel corso del tempo duplicazione decresce..(Param biologici più realistici; <<Riproducibilità, <<Reperibilità)

b) Immortalizzate (=Cell. di linea): Nascono come primarie, ma con trasformaz chimiche/alterazione codice genetico --> diventano cell 'tumorali' (si duplicano >velocem, proprietà costanti, immortali; se impiantati possono dare orig a tumore)(Standardizzazione, >>Riproducilità, >>Reperibilità; alterazione param crescita e proliferaz cellulare -> Risposta non fisiolog).. Di solito si usano le immortalizzate, perché risultati devono essere standardizzati

• Vantaggi: Sensibilità a materiali tossici; condizione sperimentali std; saggi economici e rapidi
• Svantaggi: Ipersensibilità dovuta a accumulo metaboliti/sost tossiche; Risposte sperimentali per biocompat parziale (<->non direttamente trasferibile all'uomo)

Biofunzionalità in vitro: analisi di determinati meccanismi del materiale con il tessuto; essi avvengono quando il materiale entra in contatto con il tessuto vivente (in vivo); se ciò avviene in vitro.. si presuppone avvenga anche in vivo (non sempre vero)

• 1. Attacco cellulare
• 2. Adesione (Spreading) cellulare
• 3. Proliferazione cellulare
• 4. Funzioni biosintetiche specifiche per il tessuto considerato

1 e 2: Microscopia ottica: Ingrandimento elevato + Colorazione cellule, per osservare i due fenomeni

Inibizione da contatto: Se cellula in vitro è circondata da tutte altre cellule, se sono in confluenza e su piano cominciano a morire (si ‘staccano’) causa: non riescono a costruire altro piano per aggregarsi, obbligate a stare su piano. Condizione migliore di lavoro: 70% di confluenza

Vengono anche utilizzate microscopia elettronica e a fluorescenza

2. Test in vivo (Impianti in modello animale)

Utilizzati quando test in vitro risultano positivi;

Dopo l'intervento all'interfaccia non ho solo osso. Ho bisogno di un processo di guarigione (proc infiammatorio, transitorio). Se dopo 3 mesi ho ancora processo infiammatorio massiccio vuol dire che la protesi non ha funzionato. Se micromovimento relativo tra la protesi e il tessuto che la accoglie proc inf continua => Fallimento; trovo non l’osso ma callo (più molle) o parte infiammata.

Iter di fronte a un materiale nuovo

• 1. Lo metto in ambienti diversi di temperatura e pH.
• 2. Test funzionale: sottoposto a cicli a fatica. Se rilascia qualcosa studio ciò che rilascia. In questo modo ho solo valutato la biocompatibilità funzionale.
• 3. Test in vitro: Metto mat in contatto con cellule immortalizzate e valutare ciò che succede.
• 4. Superati i 3