Appunti biochimica umana, testo di riferimento "Principi di biochimica di Lehninger"

Concetti base

• La struttura primaria è la serie di amminoacidi che compongono una proteina, dalla quale dipendono le altre tre strutture.
• La struttura secondaria è la serie di avvolgimenti della proteina, come i foglietti beta e le catene alpha.
• La struttura terziaria è la serie di interazioni fra i differenti domini di una proteina che ne definiscono una struttura tridimensionale e spaziale.
• La struttura quaternaria è la serie di interazioni che si vengono a creare fra differenti subunità che compongono un enzima, l’esempio classico è l’emoglobina.

Non tutte le proteine presentano una struttura quaternaria, ma tale struttura può modificare enormemente le caratteristiche della proteina.

Dalla struttura della proteina dipende l’eventuale formazione di un sito attivo e quindi la possibilità della proteina di avere una funzionalità biologica. Una modifica di un qualunque amminoacido può determinare la perdita totale di funzionalità della proteina.

Anfinsen e le proteine fibrose e globulari

Anfinsen sperimentò la denaturazione e rinaturazione della ribonucleasi A. La denaturazione rompeva i ponti disolfuro della cisteina, dopo denaturazione l’enzima perdeva il suo potere catalitico. Allontanata dal denaturante, urea, la ribonucleasi acquisiva nuovamente la conformazione di partenza e tutte le funzionalità, ciò a dimostrare che dalla struttura primaria dipende fortemente la struttura spaziale, le altre strutture, secondaria, terziaria e quaternaria, della proteina e la funzionalità.

Le proteine fibrose hanno catene polipeptidiche disposte in lunghi fasci, le proteine globulari hanno catene polipeptidiche ripiegate ed assumono forma globulare.

• Le proteine fibrose assumono un unico tipo di struttura secondaria ed hanno una struttura terziaria semplice mentre le proteine globulari hanno diversi tipi di struttura secondaria.
• Le proteine fibrose determinano resistenza, forma e protezione delle cellule mentre le globulari sono per lo più enzimi e proteine regolatrici.

Il collageno

Il collageno è una proteina strutturale fibrosa incredibilmente resistente costituita da una lunga struttura rigida a tripla elica formata da tre catene alfa. Le singole catene alfa sono sinistrorse mentre l'avvolgimento superelicoidale è destroso. Il collageno presenta una unità tripeptidica ripetuta: Gly-X-Pro o Gly-X-Hyp: la prolina stabilizza la conformazione ad elica di ciascuna catena alfa, la glicina che è abbastanza piccola da inserirsi nella tripla elica ne favorisce il compattamento. La glicina e l’Alanina 7 rendono possibile il Coiled Coil del collageno.

La Prolina è un amminoacido molto particolare, infatti si tratta di un amminoacido che anziché NH2, presenta NH. Generalmente si dice che quando si incontra una Prolina in un’alpha elica, l’alpha elica si interrompe in quanto la Prolina può effettuare un legame peptidico partecipando con l’COOH ma non può effettuare un successivo legame partecipando con NH2, poiché presenta NH. In alcuni casi particolari, come quello del collageno, la Prolina effettua comunque dei legami, ma assume conformazioni differenti. Ciò rende la catena alpha del collageno sinistrorsa, anziché destrorsa, con un passo più breve, 3,3 residui per giro anziché 3,6, e con un diametro inferiore.

La resistenza del collageno dipende dall’avvolgimento delle 3 eliche sinistrorse in una tripla elica, il tropocollageno, destrorsa. Questa struttura a coiled coil riduce al minimo il canale centrale delle alpha eliche e ciò conferisce maggiore resistenza strutturale alla proteina, estremamente compatta.

Rigidità anziano collageno – caratteristiche

Tanto più abbondanti sono i legami dell’idrossiprolina, che permettono la formazione di fibrille tramite legami crociati, tanto più resistente sarà il collageno, ciò ha un riscontro medico. La rigidità dell’anziano è dovuta ad un aumento di legami crociati e di legami insoliti che rendono le articolazioni molto più rigide.

• Presente in vari organi, del tessuto connettivo, dei tendini, dei denti, della cartilagine, della matrice organica, della cornea, dell’osso.
• Elica sinistrorsa con 3 residui/giro.
• Gly 35% (piccole dimensioni).
• Ala 11% (piccole dimensioni).
• Pro o Hyp 21% (amminoacido particolare).

Tendine di Achille e collagenasi

Nell’uomo 30 geni, su 12 cromosomi, sintetizzano per il collagene ed i collageni rappresentano 1/3 di tutte le proteine dell’organismo, addirittura nel tendine di Achille, la struttura più resistente del nostro corpo, è costituito al 32% da collageno. Esistono degli enzimi che si chiamano collagenasi, sono metalloenzimi, che tagliano la tripla elica del collageno a livello dei legami peptidici tra Gly-Ile e Gly-Leu.

Sintesi del collageno

Procollageno (intracellulare)

Le catene polipeptidiche del collageno entrano nel lume del ER come precursori più grandi chiamati catene pro-alfa che hanno aa addizionali chiamati propeptidi. Nel ER lisine e proline sono idrossilate in quanto il gruppo ossidrile forma legami intercatena che aiutano a stabilizzare la tripla elica. Ciascuna catena pro-alfa si combina con altre due formando una molecola elicoidale a tre filamenti nota come procollageno.

Tropocollageno (extracellulare)

Dopo la secrezione i propeptidi sono rimossi, ciò converte la molecola da procollageno in molecole di collageno che si assemblano a formare fibrille di collageno, a causa della tendenza delle molecole di collageno ad autoassemblarsi e che sono rinforzate dalla formazione di legami crociati covalenti fra residui di lisina che conferiscono resistenza alla tensione. I propeptidi hanno almeno due funzioni: guidano la formazione intracellulare delle molecole di collageno a tre filamenti e poiché sono rimossi soltanto dopo la secrezione impediscono la formazione intracellulare di grandi fibrille di collageno.

Acido ascorbico e scorbuto

Nella I tappa di maturazione del collageno si ha idrossilazione delle proline e lisine ad opera degli enzimi prolil-4 idrossilasi e lisil idrossilasi. Entrambi gli enzimi richiedono alfa-chetoglutarato per le sue reazioni. Reazioni catalizzate dalla prolil 4-idrossilasi.

Nella reazione normale di ossidrilazione della prolina l'enzima trasferisce un atomo di ossigeno sulla prolina, che diventa idrossiprolina, e l'altro atomo sul carbonio chetonico in alfa dell'alfa-chetoglutarato che perde CO2 per decarbossilazione e diventa succinato.

Durante questa reazione, inoltre, il ferro della monossigenasi è ossidato da Fe2+ a Fe3+, e la forma ossidata dell'enzima è inattiva.

Per ridurlo nuovamente entra in gioco l'acido ascorbico la cui ossidazione a deidroascorbico è accoppiata alla riduzione della monossigenasi:

Acido ascorbico + monossigenasi (Fe3+) ----> Acido deidroascorbico + monossigenasi (Fe2+)

In assenza di vitamina C, che l'uomo non può autosintetizzare tramite la conversione di glucosio in ascorbato per la mancanza dell'ultimo di una serie di quattro enzimi, le cellule non possono ossidirilare le proline nella posizione Y, ne deriva una instabilità del collageno che porta allo scorbuto, una malattia caratterizzata dalla degenerazione del tessuto connettivo che porta ad una fragilità dei vasi sanguigni, perdita dei denti, degenerazione ossea ed infine insufficienza cardiaca. Mangiare frutta e verdura è essenziale per prevenire lo scorbuto.

Proteine coniugate

Le proteine coniugate sono proteine formate da una porzione proteica ed una non proteica, il gruppo prostetico.

Gruppo eme

L’eme, o gruppo eme, o ematina, è un complesso chimico membro di una famiglia di composti chiamati porfirine contenente un atomo di ferro. L'eme costituisce il gruppo prostetico, cioè la parte non proteica, quella proteica è detta apoproteina, di una serie di proteine tra cui l'emoglobina, la mioglobina e i citocromi. Questa molecola deve la sua importanza al fatto che può legare l'ossigeno, sia in forma molecolare sia in altri composti, biossido di carbonio CO2, monossido di carbonio CO, H2O, ecc., proprio grazie all'atomo di ferro.

Struttura: l'eme è costituito da quattro anelli pirrolici legati tra loro da ponti metinici (-CH=) formando un anello tetrapirrolico. A questa struttura sono legati quattro gruppi metilici (-CH3), due vinilici (CH2=CH-) e due propionici (-CH2-CH2-COO-). L'atomo di ferro viene legato alla fine ai quattro atomi di azoto disposti al centro dell'anello. Il ferro a sua volta può formare altri due legami, uno su ciascun lato dell'eme, chiamati quinta e sesta posizione di coordinazione. Nell'emoglobina e nella mioglobina la quinta posizione è occupata da una istidina.

• Gli atomi di azoto coordinati, che hanno la caratteristica di donatori di elettroni, impediscono la conversione del ferro dell'eme nello stato ferrico (Fe3+) che a differenza dello stato ferroso (Fe2+) non è in grado di legare reversibilmente l'ossigeno.
• Quando si lega l'ossigeno le proprietà elettroniche del ferro si modificano; ciò spiega il diverso colore che ha il sangue venoso povero di ossigeno, rosso scuro, rispetto al sangue arterioso ricco di ossigeno, rosso brillante.

Globine

La maggior parte di queste proteine svolge la funzione di trasportatore o di immagazzinatore di ossigeno.

• Mioglobina: monomerica - trasporto dell'ossigeno nel tessuto muscolare.
• Emoglobina: tetramerica - trasporto dell'ossigeno nel torrente circolatorio.
• Neuroglobina: monomerica - protegge il cervello da ipossia ed ischemia.
• Citoglobina: monomerica - funzione ignota.

La mioglobina

La mioglobina è una proteina muscolare che lega l'ossigeno e la sua funzione è quella di immagazzinare l'ossigeno e di facilitarne la diffusione nei muscoli in rapida contrazione.

La mioglobina è una proteina coniugata che presenta un gruppo eme ed una struttura principalmente globulare composta da 8 segmenti alpha elica interrotti da ripiegamenti, alcuni dei quali a foglietto beta.

La maggior parte dei gruppi idrofobici si trova all'interno della mioglobina, tutti i gruppi polari meno due, sono localizzati sulla superficie esterna. Questo denso nucleo idrofobico è tipico delle proteine globulari.

I segmenti ad alfa elica vengono indicati con le lettere da A ad H, His93 viene indicato anche come His F8 ed i ripiegamenti che uniscono le alfa eliche vengono chiamati AB, CD, EF e così via, cioè con le lettere che i ripiegamenti stessi interconnettono. Sono presenti due residui di istidina, uno sull'elica F detto prossimale che si coordina con il ferro ed uno sull'elica E detto distale che coordina il legame tra l'O2 ed il ferro.

Mioglobina, emoglobina e monossido di carbonio

Il CO si lega alle molecole di eme libero 20'000 volte meglio dell’ossigeno. La maggiore affinità dell’eme per il CO è spiegabile dalla geometria dei legami che formano CO ed O2. La perpendicolarità del CO lo rende più stabile rispetto all’O2 che forma un angolo.

Quando l'eme è posizionato nella proteina l’affinità per il CO diminuisce di 100 volte rispetto all’Ossigeno. Ciò è spiegabile con la struttura, sia l’emoglobina che la mioglobina, infatti, presentano il residuo di istidina distale, residuo 7 dell’alpha elica E, che serve a stabilizzare il legame dell’ossigeno e rendere meno favorevole la struttura planare del legame del CO.

Emoglobina

L'emoglobina è una proteina tetramerica che si occupa del trasporto di quasi tutto l'ossigeno all'interno del nostro organismo e si trova negli eritrociti, cellule di piccole dimensioni che originano dagli emocitoblasti.

L'emoglobina ha una forma quasi sferica, contiene 4 gruppi eme, uno per ogni subunità. L'emoglobina A contiene due tipi di globine: due catene alfa e due catene beta. La convenzione per la nomenclatura delle alfa eliche utilizzata per la mioglobina viene applicata anche alle subunità dell'emoglobina.

La struttura quaternaria è caratterizzata da un’interazione molto forte tra le quattro subunità, abbiamo interfaccia alfa1beta1, la sua controparte alfa2beta2 e così via.

Emoglobina e mioglobina

1. La mioglobina è relativamente insensibile a piccole variazioni nella concentrazione dell'ossigeno e funziona bene come serbatoio di questo gas. L'emoglobina si adatta meglio alla funzione di trasportatore e piccole variazioni nell'interazione tra le subunità dell'ossigeno possono determinare variazioni nell'affinità per l'ossigeno.

Stato R e stato T

L'emoglobina può trovarsi in due differenti conformazioni: lo stato T e lo stato R, l’ossigeno si lega a entrambi gli stati dell’emoglobina, ma il legame con lo stato R è più forte, il legame dell’ossigeno stabilizza lo stato R. In assenza di ossigeno lo stato T è più stabile ed è la conformazione prevalente della deossiemoglobina.

Le lettere T ed R indicano rispettivamente lo stato teso e lo stato rilasciato. Lo stato T è stabilizzato da un gran numero di interazioni ioniche, molte delle quali si verificano in corrispondenza delle interfacce a1b2 ed a2b1.

Il legame di O2 ad una delle subunità nella forma T converte la subunità nello stato R.

Transizione 1

Nella transizione non si modificano sostanzialmente le strutture delle subunità ma i due monomeri alfa-beta scivolano l'uno sull'altro e ruotano restringendo così la tasca tra le subunità B. Durante questo processo alcuni legami ionici che stabilizzano lo stato T si rompono, la transizione più importante è quella dei residui di His carbossiterminali HC3 delle subunità beta che sono coinvolti in un ponte salino nello stato T e ruotano verso il centro della molecola e non fanno più parte di coppie ioniche nello stato R.

Transizione 2

Max Perutz ipotizzò che la transizione T-R venisse innescata da cambiamenti della posizione dei residui amminoacidici che circondano l'eme: nello stato T la porfirina ha una forma a cupola e pertanto il ferro all'interno dell'eme tende a protrudere dal lato dell'istidina prossimale, His F8. Il legame dell'O2 costringe l'eme ad assumere una conformazione più planare, modificando la posizione dell'His prossimale e dell'elica F ad essa legata. Queste modificazioni conducono a un aggiustamento delle coppie ioniche all'interfaccia a1b2.

Il passaggio dallo stato T allo stato R è anche chiamato ‘effetto a grilletto’. Nella forma R, l’istidina prossimale, tramite ‘un colpo’ simile a quello di un grilletto, facilita l’allineamento del ferro e quindi il legame con l’Ossigeno.

Meccanismo cooperativo

L’emoglobina ha la funzione di prelevare ossigeno dai polmoni e rilasciarlo nei capillari dove deve prelevare anidride carbonica per rilasciarla poi nei polmoni. Questa proprietà è orchestrata dalla variazione del pH e dalla variazione di pressione dei gas. Grazie ad un principio di cooperatività fra le subunità, l’emoglobina è in grado di mascherare (T) o smascherare (R) i propri siti diminuendo o aumentando l’affinità verso l’ossigeno. Lo smascheramento di un sito tende ad avere un effetto domino verso gli altri e a portare allo smascheramento dei siti adiacenti. Quindi non si ha un aumento esponenziale dell’affinità per l’ossigeno, non un effetto sommatorio ma un effetto olistico.

Per spiegare questa teoria esistono due schemi “modelli sequenziali”, a e b, a, modello concertato, prevede che tutte le subunità presentino contemporaneamente la stessa conformazione, b, modello modello sequenziale, prevede un passaggio graduale.

Equazione di Hill

Proteine allosteriche: una proteina allosterica è quella in cui il legame di un ligando ad un sito modifica le proprietà di un altro sito sulla stessa molecola proteica. I ligandi, modulatori, possono attivare o inibire. Se il normale ligando della proteina è anche un modulatore, l’interazione è detta omotropica, se è diversa dal normale ligando l’interazione è detta eterotropica.

Embolia ed anemia falciforme

Trasporto di H+ e CO2

Oltre a trasportare quasi tutto l'ossigeno dai polmoni ai tessuti l'emoglobina trasporta anche due prodotti finali della respirazione cellulare, H+ e CO2 dai tessuti ai polmoni ed ai reni dove sono escreti. La CO2 insolubile viene idratata in forma di bicarbonato dall'anidrasi carbonica per evitare la formazione di bollicine, embolia gassosa.

L'idratazione determina un aumento della concentrazione di ioni H+, una diminuzione del pH, nei tessuti e poiché il legame dell'ossigeno all'emoglobina è fortemente influenzato dal pH e dalla concentrazione di CO2 la conversione del bicarbonato diventa un processo molto importante per la regolazione del legame dell'ossigeno e del rilascio nel sangue.

Il legame di H+ e di CO2 è inversamente proporzionale al legame dell'O2.

• Nei tessuti periferici un pH relativamente basso ed una elevata concentrazione di CO2 riducono l'affinità dell'O2 man mano che H+ e CO2 si legano ed O2 è rilasciato nei tessuti.
• Nei capillari dei polmoni CO2 viene eliminata e si ha un incremento di pH e l'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno aumenta.

Effetto Bohr

Questo effetto del pH e della concentrazione di CO2 è detto effetto Bohr.

Effetto del pH. L'equilibrio della reazione dell'emoglobina con l'O2 può essere rappresentato dalla reazione:

Per spiegare l'effetto della concentrazione degli H+ è meglio riscrivere la reazione nel modo seguente:

Hhb+ è la forma protonata dell’emoglobina e scritta in questa forma l'equazione dimostra che la curva di saturazione dell'emoglobina è influenzata dalla concentrazione degli H+: quando la concentrazione dell'O2 è elevata, come nei pol