Concetti Chiave
- I test enzimatici sono complessi e utilizzati per misurare substrati o attività enzimatiche, riflettendo reazioni fisiologiche naturali.
- La misurazione del glucosio in laboratorio coinvolge due reazioni enzimatiche, con l'uso di esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi, per determinare la concentrazione di glucosio tramite NADPH a 340 nm.
- La lunghezza d'onda di 340 nm per la misurazione del NADPH è preferita per la sua elevata specificità, poiché poche altre sostanze fisiologiche assorbono a questa frequenza.
- L'alcol etilico è misurato clinicamente tramite reazioni enzimatiche che riproducono la metabolizzazione epatica, utilizzando NAD e alcol deidrogenasi, con la misurazione del NAD ridotto a 340 nm.
- I test enzimatici per glucosio e alcol etilico sono definiti all'endpoint, significando che la reazione viene completata prima di misurare l'assorbanza del prodotto.
Test enzimatici
Le reazioni enzimatiche sono test molto più complessi rispetto agli altri visti precedentemente.I test enzimatici si effettuano per determinare la quantità di un substrato o per determinare l’attività enzimatica di un enzima. Spesso queste reazioni riflettono le reazioni fisiologiche che avvengono in natura.
Si parlerà del glucosio, dell’alcol etilico, dell’urea e dell’LDH.
Glucosio
In laboratorio si riproduce la prima reazione della glicolisi: in una provetta si aggiunge il campione da analizzare, l’ATP e l’enzima esochinasi, che trasforma il glucosio in glucosio-6-fosfato, e l’ATP in ADP.
Successivamente si aggiunge alla reazione del NADP+ e l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi: in questo modo il glucosio-6-fosfato viene trasformato in gluconato-6-fosfato e il NADP+ in NADPH.
In laboratorio si misura l’assorbanza del NADPH a 340 nm. Sapendo poi che una mole di NADPH corrisponde ad una mole di glucosio-6-fosfato e quindi ad una mole di glucosio, si risale alla concentrazione del glucosio.
Quindi, rispetto alle reazioni precedenti, la reazione è più che indiretta, in quanto è costituita da due reazioni; in più si ha l’intervento di più di due enzimi per far avvenire la reazione.
La misurazione del NAD o del NADP è una tecnica di indagine molto utilizzata in laboratorio: questo perché la misurazione a 340 nm è una misurazione molto pulita, in quanto perché ci sono pochissime altre sostanze fisiologiche che assorbono a questa lunghezza d’onda. In questo modo la reazione non risulta solo sensibile, ma anche specifica
Alcol etilico
Un’ altra reazione enzimatica è quella dell’alcol etilico che viene misurato in modo automatizzato solamente a scopo clinico (il test che ha invece anche valenza medico-legale misura l'alcol etilico nei campioni di sangue tramite metodica di riferimento in gas cromatografia accoppiata a spettrometria di massa). È una misura enzimatica indiretta ed anche in questo caso si riproduce in laboratorio il passaggio di metabolizzazione dell’alcool da parte del fegato, che è il passaggio in cui l'etanolo viene trasformato in acetaldeide tramite l'enzima alcol deidrogenasi. In laboratorio:
1. si prende la provetta contenente il plasma e con all’interno ipoteticamente alcol etilico
2. si aggiunge NAD e alcol deidrogenasi che catalizza la trasformazione dell'alcol etilico in acetaldeide e del NAD in NAD ridotto
3. Anche in questo caso si misura il NAD ridotto a 340 nm e da questa concentrazione si risale alla concentrazione dell’alcool etilico.
Gli esami considerati finora (glucosio ed alcol etilico) sono test enzimatici definiti all’endpoint, questo significa che si fa avvenire la reazione fino a che non viene completata e successivamente si misura l'assorbanza del prodotto di reazione.
Domande da interrogazione
- Qual è lo scopo principale dei test enzimatici descritti nel testo?
- Come viene misurata la concentrazione di glucosio in laboratorio?
- Qual è la differenza tra la misurazione dell'alcol etilico a scopo clinico e quella a scopo medico-legale?
- Perché la misurazione a 340 nm è considerata specifica e sensibile?
I test enzimatici vengono effettuati per determinare la quantità di un substrato o l'attività enzimatica di un enzima, riflettendo spesso le reazioni fisiologiche naturali.
La concentrazione di glucosio viene determinata misurando l'assorbanza del NADPH a 340 nm, poiché una mole di NADPH corrisponde a una mole di glucosio-6-fosfato e quindi a una mole di glucosio.
La misurazione clinica dell'alcol etilico è automatizzata e indiretta, mentre quella medico-legale utilizza la gas cromatografia accoppiata a spettrometria di massa per analizzare campioni di sangue.
La misurazione a 340 nm è considerata specifica e sensibile perché poche altre sostanze fisiologiche assorbono a questa lunghezza d'onda, rendendo la misurazione molto pulita.
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