Biotecnologie delle specie erbacee - Appunti

METODOLOGIE:

predomina l'uso della pcr,

- RFLP: oggi poco usata perchè troppo la boriosa, si basa su 2 principi: uno sull'uso

dell'ibridazione in sauthern dna-dna e l'altro sul rilevamento di polimorfismi attraverso il

taglio con enzimi di restrizione; prima dobbiamo digerire, restringere il dna genomico con

enzimi di restrizione che vanno a trovare i polimorfismi cioè le differenze tra i genotipi.

Metodo dna-dna: facciamo ibridare una sonda marcata radioattivamente, va ad ibridarsi,

separiamo i frammenti ristretti come singoli filamenti denaturati poi li trasferiamo su

suppporto solidi, facciamo avvenire l'ibridazione con la sonda marcata a singolo filamento,

quella porta il tracciante radioattivo, è omologa al pezzettino tra i 2 siti dii restrizione e va a

ibridare solo li, andrà a ibridare un pò tutto il supporto solido, ma in maniera stringente

solo nel pezzettino dove c'è il suo omologo frammento ristretto legato al supporto solido.

E' un procedimento molto lungo, serve poi una grande quantità di dna per poterlo

trasferirlo su supporto solido il dna ristretto con enzimi.

- RADP: (sinonimo ap-pcr): viene dal 1990, già l'acronimo vuole significare che era un

metodo rapido per evidenziare variazione nei genotipi, si basa su un solo primer e perchè

questo solo primer possa trovare due siti di appaiamento per innescare una reazione di

pcr sia sul filamento forward che sul filamento reverce non può essere troppo lungo,

altrimenti non avrebbe la probabilità statistica di incontrare 2 strech di 20 paia di basi a

distanze amplificabili es. una chilo base, se invece il primer è più corto es. 10 paia di basi

e se le condizioni di pcr non sono troppo stringenti possiamo con una semplice aggiunta di

un primer amplificare più loci in ciascun genotipo quindi andare a trovare differenze di

sequenza; difetti:se cambiamo marca di taq il pattern cambia, se variamo le condizioni di

pcr il pattern cambia, alla fine nel pattern complesso non riusciamo a distinguere omozigoti

da eterozigoti perchè non riusciamo a seguire nel pattern quale è uno dei 2 alleli perchè

abbiamo la confusione dovuta alla amplificazione di altri loci, non solo, quando si prova ad

sequenzare bande che derivano da amplificazione rapid molto spesso queste bande sono

popolazioni di bande dello stesso peso.

- MICROSATELLITI E ISSR: issr assomigliano al sistema rapid, si basano su una diversa

fonte di variazione fra genotipi, la fonte di variazione che viene identificata da questi

marcatori è il numero di short tandem repit cioè si è visto che in natura all'interno del dna

genomico sono presenti questi short tandem repit che sono delle sequenze ripetute corte

in tandem, 2-4 paia di basi ripetute una dopo l'altra un numeto x di volte; una volta

scoperto l'abbondanza relativa di questo tipo di sequenze nel genoma dei vegetali si è

scoperto anche che esistevano differenze nelle lunghezze di questi repit tra genotipi e

queste lunghezze possono essere al limite di un singolo repit, qindi se il repit è di 2 basi la

differenza tra il genotipo 1 e il genotipo 2 sarà di soltanto 2 paia di basi, queste differenze

sono corte però facilmente riscontrabili cioè l'abbondanza di polimorfismi è grande, le

sequenze fiancheggianti questi short tandem repit sono usualmente conservate all'interno

di una specie quindi le possiamo ad andare a sequenzare e produrre dei primer che ci

consentino in buona parte di amplificare i repit più qualcosina che sta a dx e a sx; e quindi

evidenziare le differenze, e possiamo amplificare 2 alleli parentali omozigoti, allo stadio

eterozigote o omozigote per altri parentali quindi il dato è molto informativo; l'unico

problema consiste nel fatto che questi short tandel repit non li riconosciamo a priori, per

cui è impossibile andare ad amplificare direttamente, serve una libreria genomica

generalmente arricchita in sequenze microsatellite, vengono sostanzialmente selezionate

quelle che contengono microsatellite e solo questi vengono sequenzati per verede se

contengono o no i short tandem repit; quando si verifica che li contengono si producono i

primer, si prova a vedere e dopo si vede se amplifica e dopo se è polimorfico, anche

questo processo è lungo anche se hanno una affidabilità molto buona oltre al fatto che ci

danno una bella fotografia della variabilità genetica all'interno di una specie perchè

generalmente sono multiallelici cioè è facile che ci saranno individui che portano 17 di

questi repit, individui che ne portano 16 e individui che ne portano 30 e così via per cui

avremo una bella fotografia della variabilità, un altro limite è che quest tipo di marcatori è

specie specifico o esportabile all'interno di un genere, di specie molto simile. Qualcuno ha

pensato bene di abbinare la facilità d'uso dei marcatori radp con il rivelamento di

microsatelliti, amplificando le regioni che stanno tra i microsatelliti e allora si produce un

marcatore su un microsatelliti. Un altro nome per gli issr è sslp, diciamo che i short tandem

repit stanno all'interno di una categoria di marcatori molecolari chiamati vntr, perchè esiste

anche il modo di identificare le variazioni di lunghezza di sequenze minisatelliti con motivi

più lunghi ripetuti in tandem sopra le 8-10 paia di basi, quindi le variazioni sono più grandi,

l'abbondanza è relativamente minore e chi l'ha scoperta aveva iniziato a identificare

questa differenza semplicemente con una metodica di tipo rflp, oggi sono

abbondantemente abbandonati e superati dagli short tantem repit. Negli issr le differenze

sono piccole tra questi ripit per cui la separazione deve avvenire o in gel di acrilamide

colorato con nitrato d'argento o tracciante radioattivo che riesca a separare differenze

piccole; se voglio essere assolutamente sicuri della dimensione di un microsatellite devo

riamplificare, facendo una pcr sull'amplificato e vedo quali sono i frammenti più

rappresentati. Con questo tipo di analisi c'è la possibilità sia di fare più pcr e mettere

insieme i prodotti di amplificazione, fare una separazione unica soprattutto se abbiamo la

possibilità di usare coloranti diversi applicati ai primer e cosapararli, correranno comunque

tutti e due vicini, possiamo anche ottimizzando una reazione di pcr multiplexare qualche

microsatellite in pcr mettendo più primer non omologhi che non annilano tra loro, facendo

coamplificazioni per produrre più dati in un'unità di tempo.

- AFLP: se vogliamo marcatori che ci consentono di avere un nmero di dati molto elevato

per singolo esperimonto dobbiamo usare questa metodologia, gli aflp sono nati come

metodologia che unisce i vantaggi dell'utilizzo degli enzimi di restrizione a quelli della pcr

più o meno casuale nel senso cha abbiamo un procedimento abbastanza comlicato e non

immediato, i passaggi sono diversi: innanzitutto bisogna separare, dividere il dna

genomico con gli enzimi di restrizione, chi ha inventato la tecnica ha visto che la

metodologia nei vegetali il numero ottimale di frammenti ristretti si ottiene usando 2 enzimi

di restrizione: un enzima di restrizione six catter che riconosce 6 paia di basi con ecor1 e

un sito di restrizione cosiddetto 4catter che riconosce 4 paia di basi, questo perchè la

numerosità dei siti di restrizione delle 4 paia di basi per una semplice legge statistica è

molto maggiore della numerosità dei siti di restrizione di 6 paia di base. Se digerissimo

solo con un enzima di restrizione evremo un certo numero di frammenti ristretti che per la

metodologia non va bene, digeriamo con i due e peschiamo soltanto quelli che hanno a sx

un enzima o a dx un altro enzima con un primer disegnato specificamente sul sito di

restrizione. Come si fanno a ripescare? Bisogna fare inizialmente una reazione di

ligazione, aggiungendo un adattatore, un oligo che viena aggiunto al sito di restrizione con

una t4 dna ligasi, poi a questo punto abbiamo dei primer cosiddetti preselettivi che

possono essere lunghi una ventina di paia di basi includendo il sito di restrizione, quindi

aggiungiamo da una parte il primer preselettivo ecor1, dall'altro il primer preselettivo mse e

facciamo avvenire la reazione di pcr, uno sul forward e l'altro sul reverse quindi alla fine

amplificheremo soltanto quelli che avranno il forward frammenti che hanno un sito eco e

dal primer reverse quelli che hanno un sito mse facendo una preselezione. Poi si vanno a

considerare i cosiddetti polimorfismi facendo l'amplificazione selettiva: su questa

amplificazione abbiamo una grande famiglia di tanti frammenti, tutti quelli che contengono i

2 siti e sarebbero davvero tanti, inseparabili... si aggiungono dei primeer disegnati a

tavolino che cofludono il primer marcatore e che poi hanno da una a 4 basi aggiuntive

disegnati a tavolino e hanno dei nomi alfa numerici, entro certi limiti se il genoma è grande

aggiungiamo più basi casuali selettivo, se è piccolo aggiungiamo meno gìbasi comunque

sia facciamo una selezione e amplifichiamo solo quei frammenti specifici cha hanno

l'adattatore, il sito eco e quelle 2 basi che ho aggiunto io, dall'altro sul reverse hanno

l'adattatore il sito mse e quelle 2 basi che ho aggiunto io; il polimorfismo che andiamo a

identificare sono perdita di uno dei 2 siti di restrizione o allungamenti tra i 2 siti di

restrizione eco mse, il patterner è complesso difficile da discriminare però di fatto avremo

piccole delezioni ed inserzioni, perdite di questi siti; anche in questo caso è molto difficile

andare ad identificare quali sono le bande eterozigoti, difficile anche andare a rilevare

differenze di intensità: omozigote ed etero nel caso che uno dei 2 cromosomi abbia perso

uno dei due amplificati. Il vantaggio di questa tecnica è che una volta creato il pool di

frammenti della preamplificazione, abbiamo un sacco di questi amplificati che possiamo

amplificare con diverse combinazioni di primer presettivi e da poco dna di partenza trovare

un numero impressionante di polimorfismi; la potenza vera di questa tecnica è il numero di

dati ottenuti relativamente con poco sforzo con una buona affidabilità. Mancano due

corollari agli afpl che sono venuti dopo: amplificando non usando i primer sugli adattatori,

ma solo un primer sull'adattatore e un altro primer su una sequenza microsatellite, di fatto

quindi avremo i marcatori di tipo SAMPL che vanno ad amplificare solamente frammenti

aflp che honno dentro microsatelliti, sono serviti solo a chi li ha inventati...

I retrotrasposoni sono dispersi nel genoma, sono una grande parte del genoma dei

vegetali, sono sequenze non trascritte, non tradotte che fanno lo scheletro del genoma dei

vegetali e alla fine di questi retrotrasposoni ci sono delle sequenze conservate dette LTR,

se noi disegnamo un primer a tavolino su un ltr aplificheremo soltanto frammenti aflp che

contengono all'interno un retrotrasposone, anche questi lasciano il tempo che trovano...

- marcatori scar: derivano da marcatori precedenti;

- marcatori cabs: quando il polimorfismo si trova soltanto restringendo l'amplificato.

REAZIONE METODOLOFICA SUGLI SNP : un snp è un arconimo che significa un cambio

di una singola base tra 2 genotipi, siamo in un altro campo biologico di polimorfismi che è

quello delle mutazioni puntiformi, siccome la variazioni tra genotipi avvengono per

mutazioni che possono essere grossolane o puntuali, in questo caso puntiforme. Se

differenze tra genotipi sono dovute soltanto al cambio di una base il peso e la dimensione

di questi frammenti amplificati non cambia, non si vedono quindi e perdiamo un sacco

d'informazione che invece nel genoma c'è; il marcatore snp non sono altro che tutta una

serie di metodologie che consentono di rilevare queste variazioni, la frequenza di queste

mutazione puntiformi è elevata, nel genoma umano la frequenza sia di un marcatore snp

per ogni chilobase o anche meno 500-1000 paia di base (una mutazione puntiforme tra 2

genetipi), nelle piante ce ne sono ancora di più nel mais addirittura ne sono state trovate

una ogni 100 paia di basi, in genere sono più frequenti nelle piante rispetto l'uomo. Sono

frequenti anche se sono un pochino meno informativi rispetto i microsatelliti perchè sono

biallelici generalmente cioè troviamo 2 alleli, un genotipo ad es. porta una A, e un genotipo

porta una C e la differenziazione della popolazione è tutta in A-C perchè è difficile che 2

mutazioni puntiformi avvengano in uno stesso posto, (ci sono 2 diverse scule di pensiero,

c'è chi definisce come polimorfismo la presenza di un allele diverso nell'1% di una

popolazione e c'è chi lo definisce solo quando lo troviamo al 5% anche se all'1% può

bastare cioè ce sequenziamo 100 genotipi e 99 hanno una A e uno ha una C, in questo

caso non è una casualità, ma un vero polimorfismo, è un vero marcatore. E' molto più

frequente delle inserzioni, delezioni; quindi sono tante; le inserzioni, delezioni erano corte

da 2 a 38 chilobasi molte di questi riguardavano geni interi, deleti; questi snp sono più del

52% sono transizioni cioè mutazioni purina-purina o pirimidina-pirimidina cioè significa che

su un filamento una A è stata mutata in una G per cui sull'altro invece di esserci una T c'è

una C, quindi cambiamenti da A-T a G-C se vediamo un diploide; treasizioni significa

mutazioni da adenina a guanina o da timina a citosina, più del 52% sono di questo tipo le

mutazioni perchè sono le più semplici e le molecole sono molto simile quindi tra una

guanina e una citosina manca un sostituto, manca un gruppo sostituito; meno

rappresentate sono le trasversioni per motivi chimico-fisici cioè motivi di natura chimica

delle basi del dna, quanto più o meno facilmenti sono mutabili.

Gli snp dove si trovano? All'interno dei geni, nelle regioni intergeniche, in diverse parte dei

geni, sono più frequenti nelle regioni geniche che nelle regioni intergeniche

particolarmente nelle regioni 5' UTR e 3' UTR più che negli introni; dove possono essere

sli snp e che significato possono avere? Potrebbero essere in regioni non coditicanti,

oppure potrebbero essere all'interno di geni e se sono all'interno di geni possono essere in

regioni non codificanti es. introni in 5' UTR o in 3' UTR; averle in 5' UTR potrebbero

modificare la regolazione di questi geni, se sono invece nell'open riding freim cioè nel

tratto codificante sel gene potrebbero anche essere mutazioni sinonime cioè mutazioni

che non portano sostituzioni di aminoacidi, cambia la base, ma ci sono diverse triplette

che codificano per un aminoacido quindi non cambia e si chiamano mutazioni sinonime.

oppure potrebbero essere mutazioni in regioni codificanti non sinonime quindi cambiano

l'amminoacido, ma lo cambiano con un altro amminoacido che ha lo stesso chimismo, si

dicono mutazioni conservative: la proteina ha la stessa funzione; se invece cambiano gli

amminoacidi si suppone che queste siano mutazioni puntiformi in regioni codificanti, non

sininime e non conservative; gli snp più importati sono quelli che sono in regioni codificanti

non sininime e non conservative che danno si dice un polimorfismo funzionale, una

differenza nella sequenza genica che ha una relazione con la funzione; un altro tipo

importante di mutazioni snp potrebbe essere quello di essere presenti in regioni regolative,

non tutti gli snp hanno lo stesso valore se gli andiamo a vedere all'interno di una sequenza

genica, se li andiamo a vedere all'interno di un genoma anche li non avranno tutti lo stesso

valore, ne avremmo una ridondanza di dati che hanno un valore limitato e dopo una studio

di associazione di un carettere importante sapremo quali sono quelli utili (grande obiettivo

per l'industria farmaceutica). Se andiamo a riassumere i vantaggi di questi marcatori sono

diversi: gli si peculiari sono quelli delle analisi qtl con effetti minori, studi di genetica

evoluzionistica, la farmacogenomica: applicazione degli snp ai test genetici; i vantaggi dal

punto di vista metodologico sono: sono i più frequenti, sono ben spaziati anche perchè

queste mutazioni avvengono casualmente, consentono di ottenere tantissimi dati nell'unità

di tempo quindi consentono studi su larga scala cosa che tanti marcatori non fanno, e

inoltre sono codominanti quindi possono essere rilevate le 2 forme alleliche, sono

collegate alle informazioni di sequenza anzi non sarebbero potuti nascere se prima non

fossero nati i sequenziatori reletivi agli organismi viventi; sono usati per trovare

associazioni con caratteri senza dover passare attravarso popolazioni genetiche costruite

a doc.

Le fasi metodologiche di ottenimento del marcatore snp sono 2: una si chiama discovery e

l'altra detection; nella fase discovery scopriamo che tra quei 2 genotipi c'è un snp cioè un

cambio di una base (sappiamo se c'è o non c'è in questa fase) questa fase è molto

importante in specie con poca variabilità genetica per non fare troppo lavoro inutile, con la

detection lo andiamo a isolare e a identificare poi dobbiamo andarlo a renderlo visibile,

detectarlo e questa è la fase più applicativa. A fare discovery andiamo a sequenziare

utilizzando strategie alternative, nol senso che essendo il cambio di una base, il modo

migliore per vedere se c'è polimorfismo è andare a sequenziare quel frammento di

genoma in un individuo e nell'altro poi mettiamo a confronto le 2 sequenze e vediamo ad

es. che una ha una A e uno ha una C, il semplise sequenziamento di sequenze note

possono essere direttamente passati a sequenziamento e si può vedere se tra 2 genotipi

se ci siano polimorfismi. (amoliconi significa frammenti amplificati passando attraverso la

pcr) oppure si possono cercare snp in silico cioè essendo a disposizione in banche dati un

numero impressionante di sequenze soprattutto di est