Messa a punto di metodi diagnostici in real time PCR per malattie delle piante da Oomiceti del genere Phytophthora

Organismi del genere Phytophthora, presenti in habitat terrestri e acquatici, sono noti per essere i principali patogeni che vanno a colpire le radici deputate all’assorbimento delle sostanze nutritive e responsabili di marciumi del colletto di numerose piante (Moralejo et al., 2009).
Tra gli strumenti diagnostici sviluppati in patologia vegetale, la real-time PCR è risultata essere un metodo efficace in grado di rilevare e quantificare le specie di Phytophthora in ambienti diversi.
In questa tesi è stata messa a punto una metodica in real time PCR, utilizzando la chimica SYBR Green, per rilevare e quantificare alcune specie di Phytophthora in diverse matrici (tessuti vegetali, suolo ed acqua) ed in diversi ambiti: P. cactorum e cinnamomi in ambiente vivaistico; P. cambivora in bosco su piante di castagno; Phytophthora spp. su ippocastano in ambito urbano.
Sono stati raccolti campioni di corteccia da piante di castagno sintomatiche (Castanea sativa) infette da P. cambivora e da piante di ippocastano con sintomi provocati da Phytophthora spp. e campioni di suolo in castagneto. In laboratorio sono stati preparati campioni di terreno sterilizzato inoculati con P. cambivora, campioni di acqua sterilizzata inoculati con P. cinnamomi e P. cactorum e piantine di Vicia faba inoculate con P. cinnamomi e P. cactorum.
Il DNA è stato estratto da micelio fungino, materiale vegetale e acqua come descritto da Luchi et al. (2005). Il DNA dai campioni di suolo è stato estratto utilizzando FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) seguendo le istruzioni del produttore.
La metodica in real time PCR è stata sviluppata utilizzando dei primers descritti da Schena et al. (2008). Primer specifici sono stati utilizzati per rilevare P. cambivora, mentre le altre specie sono state rilevate utilizzando primers generici. La loro specificità è stata dapprima testata su DNA estratto da colture pure di Phytophthora spp. e Pythium.
Utilizzando primers specifici con la real time PCR, è stato possibile rilevare la presenza di P. cambivora nei tessuti di castagno e nel suolo inoculato con P. cambivora. Il DNA di P. cambivora è stato rilevato nei campioni di corteccia dopo una nested PCR. Mentre dai campioni di suolo presi in castagneto non è risultata la presenza di P. cambivora.
La sensibilità del metodo durante la fase iniziale della colonizzazione è stata evidenziata rilevando il DNA di P. cinnamomi e P. cactorum in semenzali di fava dopo 3, 5 e 10 dall'inoculazione. Il DNA dei patogeni è stato quantificato e varia da 103 a 104 pg/g. E 'stato anche possibile rilevare la presenza e quantificare il DNA di P. cactorum e P. cinnamomi in acqua (102 pg/g e 103 pg/g rispettivamente). Mentre dai tessuti di ippocastano non è stata rilevata la presenza di Phytophthora spp.
La sensibilità e la specificità della real time PCR sono state confermate anche in piante infette, acqua e suolo, mostrando la sua capacità di rilevare piccole quantità di DNA di Phytophthora da differenti campioni.

Esame Patologia forestale

Facoltà Agraria

Relatore Capretti Paolo

Università Università degli Studi di Firenze

Autore Valeria Mancini

A.A. 2008-2009

82 pagine

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Estratto del documento

Malattie causate da Phytophthora cinnamomi. P. cinnamomi è un patogeno delle radici di piante legnose e causa marciume delle radici fini, portando a morte le piante ospiti. Le radici di maggiori dimensioni sono solo occasionalmente attaccate. Il marciume si può estendere alla base del fusto con lesioni brune che si formano nel legno, sintomo che si può vedere scortecciando il fusto. Le foglie diventano clorotiche e appassiscono e, in base all’intensità. del marciume radicale, la pianta muore. P. cinnamomi causa anche cancri al livello del fusto, che spesso portano alla morte rapida della pianta. Altri sintomi includono: deperimenti, riduzione della dimensione dei frutti, essudati gommosi, marciumi dei frutti e del colletto, soprattutto quando la pianta viene infettata attraverso innesti vicini al livello del suolo. Le piante infette possono collassare immediatamente, ma in altri casi possono sopravvivere per diversi anni, soprattutto in aree con climi fresco umidi. Le piante asintomatiche sono spesso la maggiore fonte di diffusione di P. cinnamomi in aree ancora esenti dal patogeno e questo è uno dei maggiori problemi nei vivai. Le piante in stato di stress, allorché il suolo è eccessivamente umido o secco, sono maggiormente soggette ad infezione. Anche un utilizzo eccessivo di fertilizzanti azotati incrementa la suscettibilità delle piante e l’intensità della malattia. P. cinnamomi ha più probabilità di sopravvivere nel terreno come saprofita rispetto alle altre specie e ha la capacità di sopravvivere fino a 6 anni nei suoli umidi (Zentmyer and Mircetich 1966). Il micelio viene rapidamente degradato dai microrganismi del suolo, in particolare da Trichoderma spp. e Gliocladium spp. (Reeves 1975; Malajczuk 1983). Tuttavia il microrganismo è capace di sopravvivere per lungo tempo nel suolo attraverso la formazione di clamidospore ed è capace di colonizzare la materia organica morta (Zentmyer, 1980). La lotta nei confronti di Phytophthora cinnamomi è difficile per via del suo ampio range di ospiti, per la sua capacità di sopravvivere su piante asintomatiche, e per lo sviluppo di strutture di resistenza come le clamidospore, a profondità tali che le fumigazioni non hanno effetto (Munnecke 1972, 1984).

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