Biologia molecolare - estrazione degli acidi nucleici

Genoma e informazioni biologiche

Il genoma è il depositario delle informazioni biologiche necessarie alla costruzione e mantenimento di un organismo vivente. Fatte le dovute eccezioni (es. gameti), tutte le cellule di uno stesso organismo hanno lo stesso ed identico genoma.

Insieme di istruzioni

Le istruzioni del genoma sono interpretate ed eseguite durante l'espressione genica, che determina l'identità e la funzionalità di una cellula.

Espressione genica

L'espressione genica del genoma comporta la trascrizione e la traduzione delle informazioni genetiche.

• Trascrizione: la creazione di copie di RNA di geni attivi codificanti proteine.
• Traduzione: la formazione del proteoma, l'insieme delle proteine cellulari.

Esempio di cellule

• Cellula epatica: Trascrizione di mRNA per actina e traduzione di mRNA per albumina. Nel citoplasma: actina, miosina, albumina.
• Cellula nervosa: Trascrizione di mRNA per actina e traduzione di acetilcolina esterasi. Nel citoplasma: actina, miosina, albumina.

Componenti chiave

Actina: Subunità monomerica dei microfilamenti citoscheletrici.

Acetilcolina esterasi: Enzima che idrolizza il neurotrasmettitore acetilcolina.

Albumina: Mantiene l'equilibrio idrico.

Estrazione degli acidi nucleici (DNA-RNA)

Possibili fonti

• Tessuto (omogenizzazione)
• Coltura di cellule eucariotiche (su piastra o in sospensione)
• Coltura di cellule batteriche (in sospensione)

La raccolta delle cellule avviene mediante centrifugazione.

Lisi cellulare

• Lisozima (albume, lacrime): rompe le pareti batteriche per digestione enzimatica.
• EDTA: chela gli ioni divalenti, destabilizzando le pareti ed inattivando le DNasi.
• SDS: detergente ionico che destruttura le membrane cellulari.

Miscela complessa

Trattamento opzionale con:

• DNA - RNasi (enzima termostabile), distrugge l’RNA
• RNA - Proteasi K, distrugge le proteine
• Proteine
• Lipidi
• Carboidrati

Fenolo/cloroformio

• Fenolo: liquido che non si miscela con l’acqua.
• Cloroformio: aiuta il fenolo nella separazione dall’acqua.

Dopo agitazione e centrifugazione, si forma una fase acquosa e una organica contenente proteine.

Precipitazione a freddo con alcol e sali

Le interazioni elettrostatiche tra acidi nucleici, sali e alcol sono cruciali.

• Sali: i cationi interagiscono con i gruppi, neutralizzano la carica e diminuiscono l’idrofilicità della molecola.
• Alcol: ha una costante dielettrica inferiore a quella dell’acqua, agevolando l’interazione tra cationi e gruppi fosfato.
• Temperatura: agevola la precipitazione.

Dettagli di precipitazione

• Na⁺ - Etanolo (2,5 volumi della soluzione acquosa)
• K⁺ oppure NH₄⁺ - Isopropanolo (0,6 volumi della soluzione acquosa)
• Li⁺ per RNA

La liberazione sicura dal fenolo e la concentrazione finale sono essenziali per l'estrazione.