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PRECIPITAZIONE A FREDDO CON ALCOL E SALI

- Na + - ETANOLO (2,5 volumi della soluzione acquosa)

- K + oppure

- NH 4+ - ISOPROPANOLO (0,6 volumi della soluzione acquosa)

- Li (per RNA)

+ Liberazione sicura dal fenolo e concentrazione del campione

PRECIPITAZIONE A FREDDO CON ALCOL E SALI

+ Allontanamento

centrifugazione supernatante

etanolo 70%

centrifugazione e risospensione

allontanamento in acqua o TE

supernatante

ESTRAZIONE DNA PLASMIDICO

Metodo della lisi alcalina

La lisi si basa sull’uso di: SDS/NaOH (pH 12) in presenza di RNase A

Durante la lisi si frammenta e denatura

DNA genomico

DNA plasmidico Più piccolo e resistente subisce solo una parziale

denaturazione

Neutralizzazione con Potassio acetato (pH 5,5)

DNA plasmidico: rinatura correttamente (se la lisi non è protratta

per un tempo eccessivamente lungo) rimanendo solubile in soluzione.

L’alta concentrazione dei sali determina la precipitazione del KDS e di tutte le

proteine, il DNA genomico e gli altri costituenti cellulari intrappolati

nei complessi sale-detergente.

CETRIFUGAZIONE: per liberare la soluzione (contenente il DNA plasmidico)

Da tutte le componenti cellulari insolubili.

Metodo per separare gli acidi nucleici

Centrifugazione all’equilibrio in gradiente di densità di Cloruro di Cesio/EtBr

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

LAVAGGI ED ELUIZIONE

Fenolo equilibrato a pH 8.0 Fenolo equilibrato a pH 4.0

fase acquosa

DNA/RNA RNA

DNA/PROTEINE

PROTEINE fase organica

ESTRAZIONE RNA

Evitare l’attacco delle RNasi liberate dalla lisi cellulare

e/o introdotte mediante contaminazione

Inattivazione: Eparina, PVS, Rnasina

Distruzione simultanea alle altre proteine durante l’estrazione

SDS Proteasi K

denaturante enzima proteolitico

Fenolo Guanidina isotiocianato (agente caotropico)

distrugge le cellule.


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9

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AUTORE

flaviael

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale a ciclo unico di medicina
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2008-2009

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher flaviael di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Ventura Carlo.

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