Biologia molecolare - estrazione degli acidi nucleici

Processi cellulari e molecole coinvolte

Cellula epatica: albumina, actina, miosina, NUCLEO, trascrizione, mRNA, actina, traduzione, mRNA, albumina, albumina, CITOPLASMA

Cellula nervosa: albumina, miosina, actina, NUCLEO, trascrizione, actina, mRNA, traduzione, acetilcolina esterasi, mRNA, acetilcolina esterasi, CITOPLASMA

Acetilcolina: subunità monomerica dei microfilamenti citoscheletrici

Acetilcolina esterasi: enzima che idrolizza il neurotrasmettitore acetilcolina

Albumina: mantenimento dell'equilibrio idrico

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI (DNA-RNA)

Possibili fonti:

• Tessuto (omogenizzazione)
• Coltura di cellule eucariotiche (su piastra o in sospensione)
• Coltura di cellule batteriche (in sospensione)

Raccolta delle cellule mediante centrifugazione

LISI CELLULARE

LISOZIMA: (albume, lacrime) rompe le pareti batteriche per digestione enzimatica

EDTA: chela gli ioni divalenti destabilizzando le pareti ed inattivando le DNasi.

Polare Apolare

SDS: detergente ionico che destruttura le membrane cellulari

MISCELA COMPLESSA Trattamento opzionale con:

• DNA
• RNA

RNasi (enzima termostabile), distrugge l'RNA

RNA - Proteasi K, distrugge le proteine

PROTEINE

LIPIDI

CARBOIDRATI

FENOLO/CLOROFORMIO(FARE UN FENOLO)

FENOLO: liquido che non si miscela con l'acqua

CLOROFORMIO: aiuta il fenolo nella separazione dall'acqua

agitazione e centrifugazione

Fase acquosa

Soluzione Fenoloacquosa proteine

Fase organica

PRECIPITAZIONE A FREDDO CON ALCOL E SALI

interazioni elettrostatiche

Acidi nucleici

H2O

Sali: i cationi interagendo con i gruppi neutralizzano la carica diminuendo l'idrofilicità della molecola

Alcol: ha una costante dielettrica inferiore dell'acqua, agevolando l'interazione tra i cationi ed i gruppi fosfato

Temperatura: agevola la precipitazione

PRECIPITAZIONE A FREDDO CON ALCOL E SALI

- Na+

- ETANOLO (2,5 volumi della soluzione acquosa)

- K+ oppure

- NH4+

- ISOPROPANOLO (0,6 volumi della soluzione acquosa)

- Li (per RNA)+

Liberazione sicura dal fenolo e concentrazione del campione

PRECIPITAZIONE A FREDDO CON ALCOL E SALI

SALI+ Allontanamentocentrifugazione supernatanteetanolo 70%centrifugazione e risospensioneallontanamento in acqua o TEsupernatanteESTRAZIONE DNA PLASMIDICOMetodo della lisi alcalinaLa lisi si basa sull'uso di: SDS/NaOH (pH 12) in presenza di RNase ADurante la lisi si frammenta e denaturaDNA genomicoDNA plasmidico Più piccolo e resistente subisce solo una parzialedenaturazioneNeutralizzazione con Potassio acetato (pH 5,5)DNA plasmidico: rinatura correttamente (se la lisi non è protrattaper un tempo eccessivamente lungo) rimanendo solubile in soluzione.L'alta concentrazione dei sali determina la precipitazione del KDS e di tutte leproteine, il DNA genomico e gli altri costituenti cellulari intrappolatinei complessi sale-detergente.CETRIFUGAZIONE: per liberare la soluzione (contenente il DNA plasmidico)Da tutte le componenti cellulari insolubili.Metodo per separare gli acidi nucleiciCentrifugazione all'equilibrio in gradiente di densità di Cloruro

di Cesio/EtBr

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

LAVAGGI ED ELUIZIONE