Biostatistica - SGI, terzo anno

Settimana 1

Lezione 1 - 3/10 - Introduzione

La prima cosa da dire è che cos’è, di cosa si occupa effettivamente la biostatistica. Partiamo, però, da un’altra disciplina: la fisica. Nella fisica ho delle previsioni certe perché ho assenza di variabilità. Quando, invece, parliamo dell’ambito biologico e umano non abbiamo delle leggi e quindi non possiamo avere una previsione certa: la previsione è basata su criteri probabilistici. Nell’ambito medico la variabilità è molto grande a causa della grande varietà genetica degli esseri umani. La variabilità non può essere evitata e può confondere l’interpretazione dei dati, nascondendo degli effetti esistenti. Per questo, l’utilizzo appropriato della statistica può essere di grande aiuto nel prendere decisioni corrette nel caso di incertezza.

La biologia è lo studio del mondo vivente. Nonostante la vastità della materia, la maggior parte delle discipline biologiche implica la descrizione in ambito sperimentale e osservazionale del fenomeno di interesse in termini di variabilità assunta da alcune sue particolari caratteristiche. Ricordiamo la differenza tra i due approcci: nell’approccio sperimentale abbiamo un intervento da parte del medico nella somministrazione di qualcosa (un farmaco); nell’approccio osservazionale la popolazione osservata viene distinta in base ad una caratteristica e si osserva la risposta dei due gruppi distinti da questo fattore non somministrato. L’applicazione di metodi statistici è fondamentale per comprendere le cause del fenomeno in studio e la collaborazione tra biologo e statistico è, spesso, indispensabile. Con ricerca pre-clinica, si intende tutti gli studi che vengono fatti prima di arrivare alla sperimentazione sull’uomo. Per la maggiore si utilizzano cellule, cavie da laboratorio come topi o pesci. Sia nella ricerca pre-clinica che in quella clinica, il rapporto tra statistica e medicina è importante.

La biostatistica è la disciplina che si occupa dello sviluppo e dell’applicazione di metodi statistici per lo studio dei fenomeni propri delle scienze naturali e della medicina.

Passi della ricerca in campo biologico

• Il primo passo per progettare una ricerca è capire a quale (1) domanda si vuole rispondere.
• Dopo aver posto la domanda in termini biologici, la si pone in termini statistici, individuando (2) un’ipotesi nulla biologica e un’ipotesi alternativa biologica. L’ipotesi nulla serve per calcolare una probabilità condizionata che serve al rifiuto: infatti, il biostatistico spera di rifiutare l’ipotesi nulla che rappresenta il contrario di quello che voglio dimostrare.
• Il terzo passo è la rilevazione delle variabili per rispondere alla domanda e, in particolare, la (3) natura di tali variabili. Ovviamente la variabile più importante è quella di interesse o risposta.
• Il passo successivo (4) è porre le domande in forma di ipotesi nulla e alternativa statistica. Si individua la miglior sintesi (la media) per vedere se ho delle variazioni tra i diversi livelli degli esperimenti. Nell’esempio che stiamo vedendo (esperimento sulle mosche) i livelli dell’esperimento sono le 4 modalità di formazione di una certa proteina. Nel metodo dell’ANOVA, l’ipotesi nulla è che le medie degli n gruppi sono uguali; quella alternativa è che ci sia una differenza tra le medie.

Ora che ho ben chiara la domanda e l’ho “trasformata” in linguaggio statistico, il passo successivo è valutare la (5) numerosità campionaria necessaria, progettare il disegno dello studio e il test statistico da utilizzare. Ricordiamo che data la stessa numerosità campionaria (ANOVA bilanciata) garantisce una maggiore potenza statistica nell’individuazione delle differenze tra gruppi. Il test one-way ANOVA è chiamato in questo modo perché c’è un solo fattore che pone la differenza tra i gruppi. Il test che permette di prendere una decisione è il test f. Per applicare questo metodo, dobbiamo verificare che la popolazione a cui la applichiamo sia di tipo gaussiano.

La numerosità campionaria mi permette di avere dei test più o meno potenti: la numerosità deve essere adeguata ma nello stesso tempo deve evitare di portare un soggetto a sperimentare qualcosa di potenzialmente dannoso. Per avere una numerosità adeguata è importante andare a considerare la potenza del test. Solitamente si utilizza il 95% -> tollero un errore del primo tipo del 5% (dico che c’è un effetto quando non c’è). Se l’effetto che mi è aspetto è piccolo, allora per osservarlo ho bisogno di un campione più grande. Al contrario, se mi aspetto un grande effetto lo posso osservare in un campione più piccolo. Per trovare la numerosità campionaria c’è una procedura in SAS chiamata proc power.

Dopodiché, si può iniziare a condurre lo studio (6). In questo punto del progetto, lo statistico esce un po’ di scena perché è compito del biologo andare a raccogliere i dati sul campione individuato. Se nel corso delle analisi, mi accorgo che non trovo ciò che mi aspettavo, posso decidere di andare a sospendere lo studio.

Per prendere una decisione, occorre sottoporre i dati raccolti ad un (7) test statistico. Prima di sottoporre i dati al test, è necessario capire se i dati sono effettivamente conformi al test che ho scelto. In caso contrario, si cambia test. Per applicare l’ANOVA assumiamo che: le osservazioni siano indipendenti, le popolazioni abbiano la stessa varianza (omoschedasticità) e che la variabile risposta si distribuisca in modo normale.

Ora possiamo applicare il test scelto (8). L’elemento fondamentale del test è il p-value: la probabilità di osservare le condizioni sotto l’ipotesi nulla (quindi la rifiuto se il p-value è molto basso, minore di alfa). Ricordiamo che il p-value è la probabilità condizionata di osservare una certa situazione sotto l’ipotesi nulla.

In ultimo, dobbiamo comunicare in modo efficiente i (9) risultati ottenuti. Solitamente, per visualizzare i risultati dell’ANOVA utilizziamo i box plot.

Lezione 2 – 4/10

• Breve introduzione a SAS

SAS è il software per la gestione dati più utilizzato nell’ambito delle analisi mediche. Nasce come software per fare analisi multivariata ma spesso viene usato semplicemente per gestire grosse banche dati. Ha anche degli elementi che possono caratterizzarlo come linguaggio di programmazione. Alcuni metodi statistici sono già implementati e vengono chiamati procedure.

Abbiamo 3 finestre generali: l’editor, dove scrivo il programma; il log, la parte dove vedo l’esecuzione del programma; l’output, mi permette di vedere quello che ho creato. Per il programma d’esempio, iniziamo creando il dataset (da immaginare come un foglio Excel). Questo si fa con l’opzione data. Quando scriviamo data è come se aprissimo un foglio Excel. Dopo l’opzione “data” dobbiamo dare il nome al dataset. Per chiudere il comando è necessario utilizzare il “;”. Quando utilizzo un blocco di comandi che servono a modificare il dataset (righe e colonne) sto eseguendo un data step o passo di data. I data step iniziano con la parola “data” e si chiudono con il comando run.

Per riempire il dataset, utilizzo il comando input a cui accosto il nome delle variabili separate da spazi. Per riempire le righe utilizzo i comandi cards o datalines. Ovviamente non creeremo mai dei dataset a mano però è bene conoscere questa procedura. Il nostro dataset viene salvato nelle librerie di lavoro. In particolare, se non specifichiamo la libreria in cui inserirlo, il dataset viene messo nella libreria work. Questa è temporanea e viene svuotata dopo il log out. Attenzione: se apriamo il dataset in vista, questo non può essere modificato; il dataset deve essere sempre chiuso.

• Importazione di dati Excel (.xlsx)

Per importare i dati è necessario utilizzare la proc import. Nella procedura indichiamo il file con il suo percorso. Tutto ciò va inserito nella parola chiave “file”. Una volta individuato il percorso del file, per trasformalo in un dataset, utilizziamo la funzione out, per specificare il nome, e la funzione dbms, per indicarne il formato. In aggiunta, possiamo mettere la funzione replace: se esiste già un dataset con il nome che indichiamo, lo sostituisce. Per completare il tutto aggiungiamo getnames = yes per indicare che nella prima riga abbiamo il nome delle variabili. Di solito questa funzione è implicita nella proc import, quindi spesso non è necessario specificarla. Questa procedura non funziona nel cloud ma solo se abbiamo SAS sul computer/macchina virtuale. Per farlo nel cloud dobbiamo prima fare l’upload del file nella cartella di SAS e da lì copiarne il percorso, che si trova sempre in proprietà.

Lezione 3 – 7/10

Ora andiamo a vedere come si creano nuove variabili, come se ne selezionano solo alcune e ad attuare alcune manipolazioni. Per fare queste operazioni bisogna aprire un data-step. Innanzitutto, scriviamo la parola “data” e di fianco il nome di un nuovo dataset (oppure dello stesso se vogliamo modificarlo), poi con il comando set apriamo il dataset che vogliamo manipolare. Ora possiamo inserire nuove variabili, semplicemente scrivendo il nome di tale variabile e il valore/formula che contiene.

Per selezionare le righe solo con determinate caratteristiche, utilizziamo gli operatori logici if-then-else. Per mettere più condizioni possiamo usare anche and-or-not. Per evitare di scrivere più condizioni di or, creiamo un vettore di nomi e utilizziamo il comando in (ad esempio: if team in (‘red’, ‘blue’, ‘green’).

Qualsiasi operazione sulle colonne (ad esempio sintesi dei miei record) deve essere svolta con una procedura (proc-step). Una delle procedure più classiche è la proc means. Altre procedure sono la correlazione (proc corr), la regressione (proc reg). Per fare procedure su sottogruppi di dataset basta usare l’istruzione class.

Per costruire una variabile binaria, basta fare una costruzione if-then. Un’altra procedura importante è la proc freq: questa procedura ci permette di ottenere le frequenze. Per indicare di quale variabili vogliamo le frequenze si utilizza il tables. Se vogliamo le frequenze incrociate dobbiamo separare le variabili con un asterisco. Per chiedere di eliminare alcuni elementi basta inserire uno / e scrivere ciò che non vogliamo.

Nell’analisi statistica a volte è molto utile andare a disegnare dei grafici. La procedura che permette di disegnare i grafici è la proc sgplot. I plot più comuni da realizzare sono: istogrammi, scatterplot e box plot.

Un’altra funzione interessante è quella di poter costruire tabelle a doppia entrata, indicando per ogni incrocio tabellare potendo inserire le frequenze. Per fare ciò è necessario seguire queste istruzioni:

Settimana 2

Lezione 4 – 10/10

• Uso intuitivo dei test statistici

Per capire come funzionano i test statistici: esaminiamo una situazione di esempio in cui un medico sostiene che i pazienti affetti da una patologia hanno un BMI medio più alto di 28.4.

Dopo aver esaminato la situazione, la prima cosa da fare è impostare l’ipotesi nulla del nostro test statistico. Per verificare le ipotesi andiamo a concentrarci sulla media della variabile di interesse. Per analizzare il nostro campione, dobbiamo fare delle analisi descrittive. Nell’esempio, la media del BMI è 28,4: dobbiamo effettivamente verificare se la media del campione per il BMI è pari o maggiore a tale valore.

Per quantificare se questa differenza è significativa mi devo porre questa domanda: qual è la probabilità di osservare una media maggiore di 30.1, condizionata dal fatto che i miei pazienti derivano da una popolazione con media 28.4 (ipotesi nulla)? Per rispondere a questa domanda ho bisogno di conoscere la distribuzione della media campionaria: a quel punto potrei calcolare la probabilità che mi serve. L’assunto principale è che il BMI ha una media di 28.4 e deviazione assunta pari a 3. Ora ci chiediamo: qual è la distribuzione della media campionaria se il campione di 16 elementi ha la distribuzione appena descritta? Dobbiamo simulare dei dati. Per avere una simulazione più accurata è necessario estrarre molti campioni caratterizzati dalla stessa media, deviazione standard e numerosità campionaria.

Ricordiamo che la variabilità campionaria è funzione di 2 elementi: a numeratore troviamo la variabilità del fenomeno e a denominatore la radice quadrata della numerosità campionaria: più è grande il campione più la stima della media campionaria è precisa. La deviazione standard della media campionaria è chiamata standard error.

Quello che ora devo andare a cercare è calcolare quante volte è possibile andare a trovare nei campioni una media maggiore di 30.1, sotto l’ipotesi nulla (ovvero se il campione è estratto da una popolazione di media 28.4). È possibile fare a mano questo conto creando una variabile binaria dove l’1 indica il superamento di 30.1. Nella nostra simulazione ciò avviene in 50/5000 campioni (1%). Posso dire che la probabilità che stavamo cercando è pari a 1%. Questa probabilità è nota come p-value. Se la probabilità è molto bassa, allora è probabile che il mio campione arrivi da una popolazione con media diversa.

L’errore che commettiamo (di tipo 1) è la probabilità di rifiutare la mia ipotesi nulla quando è vera. Tutto quello che abbiamo fatto è supportato dalla teoria: la media campionaria di un campione con numerosità n è distribuita come una normale di media pari alla media della popolazione e sigma pari a sigma/radice di n. Quindi, per calcolare la probabilità che ci serve, basta calcolare l’area che sta sotto la curva (con un integrale) e ad un livello di probabilità noto (di solito 0.05).

Invece di lavorare con la media osservata, andiamo a sottrarre il valore dell’ipotesi nulla, vedendo lo scostamento dall’ipotesi nulla. Se dividiamo ora tutti questi nuovi valori per la loro deviazione standard otteniamo una normale con media molto vicina a 0 e deviazione standard molto vicina a 1. Una distribuzione normale con questi valori prende il nome di variabile standardizzata o Z. Quando abbiamo una variabile normale con sigma conosciuta possiamo applicare la statistica test Z e, facendo riferimento al p-value (errore di primo tipo) possiamo vedere se l’ipotesi nulla è supportata dai dati o meno. La statistica è data da: - μ-x 0Z =-/ nσ √.

Quanto visto finora vale a condizione che:

• Conosciamo la deviazione standard della variabile di interesse.
• La variabile è distribuita normalmente. Spesso, in ambito biologico e clinico, si ha a che fare con variabili che sono distribuite approssimativamente come una normale (o che, mediante trasformazioni, possono essere ricondotte a una normale).

Quindi, per ora, teniamo buono l’assunto (2), ma facciamo cadere l’(1).

• Statistica t

Quando calcoliamo la statistica di interesse z, potremmo sostituire a sigma una sua stima. La stima migliore potrebbe essere quella che abbiamo ottenuto direttamente dal campione (chiamiamo s la stima campionaria di sigma). Il problema è che la statistica calcolata, non è più distribuita come una normale standardizzata Z. La distribuzione di questa statistica, nota come t di Student, dipende dal numero di osservazioni su cui si basa il calcolo della media campionaria (gradi di libertà). Con 16 osservazioni, si parla di t (15 df) (i gradi di libertà – degrees of freedom, df - sono pari a n-1).

- μ-x 0 ( )~ dl 1= -/ n t S / n√.

Al crescere del numero di osservazioni, la v.c. t di Student somiglia sempre di più a una normale. Quando abbiamo numerosità campionarie superiori a 30, effettuare un test statistico basato sulla statistica t o la statistica z è nella pratica indifferente. I software statistici calcolano comunque il test t, anche per campioni grandi. L’area lasciata a destra dalla statistica t (il p-value) è maggiore rispetto a quella lasciata dal test z effettuato in precedenza. Questo perché la statistica t è leggermente più dispersa rispetto alla z.

Il test t per un campione è indicato quando si vuole confrontare la media di una variabile di interesse misurata in un campione di piccola numerosità rispetto a un valore ipotizzato. È valido (nel senso che fornisce dei valori di p-value corretti) quando la variabile di interesse è distribuita come una normale. In realtà, quando n è grande, anche l’assunto di normalità non è più necessario. Infatti, grazie al teorema del limite centrale (CLT), possiamo valutare con un test z (o un test t se non conosciamo deviazione standard della popolazione) l’ipotesi nulla di interesse senza commettere errori. Infatti, il CLT ci garantisce che, data una distribuzione di probabilità qualsiasi della variabile di interesse con media e varianza, la distribuzione della media campionaria tende sempre a una normale con media mu e varianza sigma.