Analisi dei medicinali 1 - parte 1 di 5

Lezione 1: analisi dei medicinali 101/03/2023

L’esame comprende una domanda preliminare che riguarda la preparazione di una soluzione, come vedremo la preparazione delle soluzioni è alla base dell’analisi chimica quantitativa, se non sappiamo preparare la soluzione l’esame si conclude.

Dopo verrà chiesto una domanda teorica con descrizione di un’analisi svolta in laboratorio e così via.

Il corso si chiama “analisi dei medicinali”, come introduzione del corso andremo a vedere il significato del termine, quindi che cosa significa analisi e che cosa significa medicinale.

Analisi chimica

Incominciamo dal primo termine, ossia “analisi”.

Analisi sta per analisi chimica, le analisi chimiche si distinguono in due famiglie:

• Analisi chimiche quantitative, queste vengono chiamate anche determinazioni, quindi “determinazione di un composto”, si va invece a determinare la quantità di uno o più componenti del campione.
• Analisi chimiche qualitative, quello che si va a fare è andare a vedere da quali componenti è costituito il campione che è oggetto di analisi.

Queste due famiglie di analisi chimiche, quantitative e qualitative, sono due famiglie che hanno una numerosità molto differente tra di loro, perché nella realtà la maggior parte dei casi la maggior parte delle analisi sono di tipo quantitativo e non qualitativo, perché?

È molto difficile che uno debba andare ad identificare i componenti del campione, in realtà nel corso di analisi dei medicinali 2 ci si occupa di analisi qualitativa, abbiamo una singola sostanza e non una miscela di sostanze. Nella realtà dei fatti, nella maggior parte dei casi, quando uno deve effettuare un’analisi, conosce già l’origine del campione, quindi sa più o meno da quali componenti è costituito, ne deve determinare la quantità. È molto difficile che si debba analizzare un campione di cui non si conosce niente.

Ad esempio, in un’analisi chimico clinica come le analisi del sangue, non si va a ricercare qualsiasi componente, il medico prescrive determinati valori, come proteinemia, glicemia, quantità di elementi corpuscolati nel sangue, nelle analisi del sangue non si vanno a ricercare tutti i componenti che possono essere presenti nel sangue, quindi, è un’analisi mirata ed è un’analisi quantitativa.

Se passiamo al campo farmaceutico, supponiamo di dover andare a determinare una specialità medicinale, ad esempio l’aspirina, nelle compresse di aspirina si sa già che c’è l’acido acetilsalicilico che è il farmaco, il principio attivo, poi ci sono gli eccipienti che fanno in modo che si abbia la realizzazione della forma farmaceutica, quindi non ci dovrebbero essere altri componenti, anzi non ci devono essere.

Quello che si può fare è andare a vedere che i 500 mg di acido acetilsalicilico dichiarati per singola compressa di aspirina siano effettivamente presenti, quindi non si vanno a cercare tutti i possibili farmaci in una compressa di aspirina, si sa già da cosa è costituita.

Oppure, pensiamo a quando sentiamo nei telegiornali, anche in televisione, telefilm e serie tv varie, le forze dell’ordine possono sequestrare delle bustine che contengono una polverina, questa cosa potrebbe essere?

Non è che ci possono essere molte cose, a seconda del sequestro sappiamo cosa si sta andando a ricercare, si possono andare a ricercare degli stupefacenti, oppure anche degli esplosivi, ma non si va a cercare l’aspirina nella polverina sequestrata, si fanno delle analisi mirate.

Quindi, nell’oltre il 90% dei casi le analisi chimiche che si fanno sono analisi chimiche di tipo quantitativo, che si chiamano “determinazioni di un composto”, mentre analisi di composto è l’identificazione dei costituenti del campione.

Analisi quantitativa

Scelta del metodo di analisi

1) Scelta del metodo di analisi, per andare a determinare quantitativamente il costituente.

Abbiamo fatto l’esempio prima, la quantità di acido acetilsalicilico in una compressa di aspirina, qui come si fa a scegliere il metodo di analisi? Il farmacista ha studiato analisi dei medicinali 1 quindi può avere un’idea, ma è aiutato da testi di riferimento che sono testi ufficiali, di legge, quali la Farmacopea Ufficiale, la Farmacopea Europea, oppure altri testi di riferimento che vanno a descrivere delle metodiche analitiche opportune per quella sostanza di cui determinare la quantità.

Su una sostanza che invece è nuova, allora bisogna riferirsi alla letteratura scientifica su sostanze simili, nel caso la sostanza sia di nuova preparazione bisogna procedere con il metodo analitico opportuno, questo viene fatto ad esempio nell’industria farmaceutica, quando si scopre un nuovo principio attivo, bisogna anche identificare la metodica analitica che consenta di effettuare la determinazione quantitativa.

Nella maggior parte dei casi, questo sarà così anche nelle esercitazioni, il metodo di analisi è noto.

Noi abbiamo come testo di riferimento la Farmacopea Ufficiale.

Ottenimento del campione

2) Ottenimento del campione, omogeneo e rappresentativo, altro passaggio che è fondamentale per ottenere dei risultati analitici consistenti, è quello di ottenere un campione omogeneo e rappresentativo dell’intera sostanza che è oggetto di analisi. Questo in alcuni casi può essere molto semplice, in altri casi è una questione molto complessa e delicata, perché se non si sceglie opportunamente un campione che sia rappresentativo e omogeneo dell’intera sostanza in esame, i risultati che si ottengono possono essere completamente sballati, quindi non riflettere quella che è la realtà dei fatti.

Ritorniamo, ad una matrice su cui effettuare delle analisi quantitative che è la più semplice, quindi una matrice liquida, il sangue o il plasma. Noi sappiamo che il sangue circola all’interno del nostro organismo e benché la sua composizione non sia esattamente identica in tutti i distretti dell’organismo, una volta che viene effettuato un prelievo venoso si può assumere che quella sia la composizione del sangue di quel determinato individuo. Perché? Perché abbiamo il cuore che fa in modo che ci sia un rimescolamento, il sangue viene così ossigenato, ripulito attraverso la filtrazione renale e quindi si ha un campione omogeneo e rappresentativo, quindi bisogna effettuare semplicemente il prelievo, poi ci può essere qualche operazione per separare dei costituenti che disturbano.

Quindi, se il medico prescrive di andare a determinare il contenuto di ferro che è essenziale per quale funzione? Per il funzionamento dell’emoglobina, questa contiene ferro e ci consente di legare l’ossigeno.

Andare a misurare il contenuto di ferro nel sangue, ossia il contenuto di emoglobina, il contenuto di ferro nell’emoglobina, è molto semplice, ma a volte è necessario andare a misurare il contenuto di ferro non nel sangue, ma in altri tessuti, ad esempio a livello epatico. Perché a livello epatico? Il contenuto di ferro a livello epatico è un parametro da monitorare, ad esempio nei pazienti talassemici, che sono sotto terapia chelante, quei pazienti che sono sottoposti a trasfusioni accumulano ferro, soprattutto a livello epatico e questo surplus di ferro può dare dei danni.

Questi pazienti devono seguire una terapia chelante, poi vedremo cosa sia un agente chelante nel corso delle lezioni, quindi somministrare dei farmaci che sono in grado di andare ad abbracciare con le chele, in realtà sono funzioni chimiche, il ferro, consentirne così l’eliminazione, anziché avere l’accumulo a livello epatico. Il fegato è la ghiandola più grande che abbiamo nel nostro organismo, ha una massa consistente e non tutte le regioni del fegato accumulano il ferro in maniera identica, quindi per analizzare il contenuto di ferro a livello epatico bisognerà fare un prelievo di tessuto epatico, anche qui non si può fare il prelievo in una zona qualsiasi, perché non si otterrebbe un campione omogeneo e rappresentativo.

Bisogna andare a fare il prelievo di tessuto epatico in quella zona del fegato che si sa che contenga un contenuto medio di ferro, non in quella zona che ha contenuto più alto della media, né nelle zone che hanno un contenuto più basso della media, altrimenti non effettuando un idoneo campionamento si rischia di sottostimare la quantità di farmaco chelante da somministrare al paziente, oppure di sovrastimare. Abbiamo fatto due esempi di analisi biologiche.

Ritorniamo invece alla preparazione dei farmaci, alla compressa di aspirina. La Bayer di compresse di aspirina ne produce milioni al giorno, naturalmente non va ad analizzare il contenuto di acido acetilsalicilico in ogni singola compressa, deve ottenere quindi un campione omogeneo e rappresentativo.

Supponiamo che in un turno di produzione che corrisponde al lotto, se notiamo nelle confezioni dei medicinali vi è riportato il lotto, dove questo indica il turno di produzione.

Supponiamo che in un turno di produzione siano state prodotte 1 milione di compresse di aspirina, naturalmente per effettuare l’analisi si utilizzeranno un centinaio di compresse, dove si vanno a prendere? Come si effettua questo campionamento? Bisogna prendere un po’ di compresse all’inizio del turno di produzione, durante la fase di produzione, un po’ alla fine e così via. In modo tale da avere un campione omogeneo e rappresentativo, perché all’inizio della produzione, a metà oppure alla fine della produzione, può essere successo qualche cosa, per cui la quantità di acido acetilsalicilico è inferiore o superiore ai 500 mg dichiarati, anche questo è un esempio relativamente semplice.

Pensiamo invece, a quello che può succedere in un’analisi pre-produzione, ad esempio la Bayer compra, perché non lo produce sicuramente in casa, tonnellate di amido che è uno dei costituenti delle compresse di aspirina, quindi deve verificare che con l’ottenimento di un campione rappresentativo ed omogeneo, che in quelle tonnellate vi sia amido con le caratteristiche presenti all’interno della Farmacopea.

Anche qui, cosa fa? In 10 tonnellate, apre un sacco campione e fa l’analisi a quello? No! Si devono effettuare dei prelievi ad ogni sacco, non soltanto dalla sommità del sacco ma in modo da avere un campione omogeneo e rappresentativo.

Ancora più difficile è il caso in cui il campione non è un campione costituito in maniera omogenea, come nei casi che abbiamo illustrato fino ad ora, ma supponiamo di dover analizzare i costituenti di un materiale di cava, quindi ci saranno massi da centinaia di tonnellate, ci sono sassi più o meno grossi, ci sarà ghiaietta, ci sarà sabbia, ci sarà polvere, qui naturalmente bisogna prendere un pochino di tutte queste cose per avere un campione omogeneo e rappresentativo e naturalmente questo comporta ulteriori difficoltà.

Dopo che si è ottenuto finalmente questo campione omogeneo e rappresentativo, questo dev’essere preparato per l’analisi, normalmente noi verremo messi in una situazione ottimale in cui abbiamo il campione pronto per l’analisi, ma questo in realtà non succede. Prendiamo sempre l’esempio della cava, non si prende un masso, non ci entra nemmeno in laboratorio e anche se abbiamo la pietrolina questa non può essere analizzata, dev’essere ridotta in polvere più o meno grossolana per poter effettuare l’analisi.

Preparazione e trattamento del campione

3) Preparazione del campione per l’analisi.

4) Definizione dei campioni replicati, bisogna definire quanti replicati fare dell’analisi, non si fa solo un’analisi, ma si hanno tutta una serie di replicati.

5) Solubilizzazione, i vari campioni devono essere solubilizzati in un opportuno solvente i campioni.

6) Eliminazione di eventuali componenti interferenti, bisogna eliminare le sostanze che potrebbero interferire con le analisi, ossia noi stiamo cercando un componente o più componenti di cui dobbiamo determinare la quantità, si devono eliminare tutte le altre eventuali sostanze che potrebbero reagire in maniera identica o analoga al componente di cui dobbiamo determinare la quantità.

Oppure quei componenti che ad esempio possono andare ad interferire con i metodi di identificazione del punto di fine della determinazione.

7) Prelievo di una quantità esattamente nota di campione, bisogna prelevare una quantità esattamente nota di campione e questo si può fare attraverso una misura della massa, utilizzando un’opportuna bilancia, oppure prelevando una quantità esattamente nota di un volume della soluzione che abbiamo preparato.

8) Determinazione vera e propria, utilizzando il metodo di analisi scelto nella prima fase, dopo tutte queste fasi preliminari bisogna effettuare la determinazione quantitativa vera e propria, utilizzando il metodo descritto nella prima fase, quindi il metodo di analisi scelto.

9) Calcolo dei risultati, una volta effettuata la determinazione bisognerà effettuare dei calcoli per ricavare la quantità della sostanza e andare a valutare la qualità di questo dato analitico, effettuando anche la stima della sua attendibilità.

10) Valutazione dei dati analitici, stima della loro attendibilità, si deve valutare la qualità di questo dato analitico, effettuando la stima della sua attendibilità, quindi andando a confrontare i risultati dei diversi campioni, utilizzando opportune metodiche di statistica.

Errore, precisione e accuratezza

Nella valutazione dei dati analitici quello che si determina è l’errore. L’errore in realtà, nessuno di noi lo può conoscere, perché nessuno di noi può avere contezza del valore vero, perché anche questo valore vero è stimato. Ad ogni modo, l’errore è la misura di quanto si allontana dal valore vero il risultato analitico sperimentale, questo errore può essere assoluto, che descrive quanto detto, oppure può essere relativo, anche questo lo abbiamo visto in chimica analitica.

In qualsiasi misura analitica bisogna tener conto dell’accuratezza e della precisione, la precisione è la riproducibilità del dato analitico ossia ripeto l’analisi 10 volte ed ottengo dei risultati che sono molto simili l’uno con l’altro.

L’accuratezza dell’analisi invece è il grado d’accordo tra il valore vero e il valore numerico del risultato analitico ottenuto.

Metodi di analisi quantitativa

• Metodi chimici.
• Metodi chimici fisici.

Ci occuperemo di analisi quantitative, le analisi quantitative si possono effettuare utilizzando dei metodi chimici oppure dei metodi chimici fisici, o delle combinazioni dell’uno e dell’altro.

Nei metodi chimici di analisi quello che si deve andare a determinare è la quantità X incognita dell’analita, nei metodi chimici di analisi si sfrutta una reazione tra l’analita e un reagente, che reagiranno tra di loro secondo una stechiometria ben definita, quindi con coefficienti stechiometrici m, n per quanto riguarda il reattivo per andare a formare il prodotto A R. m n

Considerando questa reazione generale, nei metodi chimici di analisi si può andare a determinare la quantità di prodotto che si forma quindi la quantità w, oppure si può andare a misurare la quantità di reagente necessaria per reagire con l’analita presente. Lo vedremo anche in successive lezioni, ma perché questo si possa fare, andare a misurare la quantità del prodotto formato o la quantità necessaria di reattivo che reagisca con tutto l’analita, è necessario che questa reazione chimica abbia una caratteristica ossia di essere spostata quantitativamente verso destra, cosa significa?

Parlando, abbiamo commesso un errore prima, ossia la docente ha detto “il reagente che reagisce con tutto l’analita”, perché ha commesso un errore? L’errore sta in “tutto l’analita”, perché è sbagliato?

Le reazioni sono sempre all’equilibrio (questo è un errore che molti fanno, ossia dire che le reazioni non siano all’equilibrio) in qualsiasi momento, questo equilibrio dev’essere spostato quantitativamente verso i prodotti, cosa significa “quantitativamente”?

Che può rimanere in soluzione dell’analita, ma non ce ne accorgiamo, perché non ho degli strumenti opportuni che mi permettono di misurare quella quantità di analita che rimane in soluzione o che non reagisce con il reattivo, qui è un concetto che dobbiamo portare avanti per tutto il corso e per tutta la nostra formazione.

Chi comanda è lo strumento di misura che mi consente di misurare la quantità di una sostanza, quindi se è uno strumento come la bilancia che ci permette di misurare come più piccola quantità 1 mg di sostanza, quella sarà la risoluzione del mio metodo, quindi se anche parte di analita non reagisce, se questa parte è inferiore ad 1 mg io non lo potrò mai sapere.

Questa è la differenza tra spostata quantitativamente e “tutto”, tutto è un concetto che non esiste, è sbagliato dire tutto, noi tendiamo ad avere metodo analitico tale per cui tutto l’analita reagisce con il titolante, però siamo limitati che non abbiamo strumenti che ci consentano di andare a misurare masse molto piccole.

Questo significa che ogni volta che noi riportiamo un dato analitico, dobbiamo tener conto di quella che si chiama “risoluzione dello strumento” che usiamo, e quindi non possiamo riportare un dato analitico con un’approssimazione superiore alla risoluzione dello strumento che utilizziamo, quindi, se noi abbiamo una bilancia la cui risoluzione è 1 mg non potrò scrivere come risultato dell’analisi 0.5 mg, questo è un risultato inventato perché non l’ho potuto misurare.

Ossia, non posso indicare che il campione contiene 2.53 mg, perché