Palmitoiletanolamina nella dispepsia funzionale

Università degli Studi di Napoli Federico II

Scuola di Medicina e Chirurgia

Corso di Laurea Magistrale in Scienze della Nutrizione Umana

Coordinatore Prof. Giovanni Annuzzi

Tesi sperimentale

Efficacia della palmitoiletanolamina (PEA) nella dispepsia funzionale

Efficacy of palmitoylethanolamide (PEA) in functional dyspepsia

Relatore: Ch.mo Prof. Giovanni Sarnelli

Controrelatore: Ch.ma Prof.ssa Nadia Maddaloni

Candidata: Fabiana Castiglione matr. N71000593

In collaborazione con: Dott.ssa Marcella Pesce

Anno accademico 2022/2023

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Ai miei genitori, autori indiscussi del mio successo

A mia figlia Alba

Al mio compagno Roberto

Alla parte di me che pensava di non farcela

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Indice

Riassunto .................................................................................... pag.4

Summary ....................................................................................... pag.8

Introduzione ............................................................................pag.9

Capitolo I: Dispepsia funzionale

1.1. Definizione ........................................................................ pag.15

1.2. Epidemiologia .................................................................. pag.16

1.3. Fattori di rischio .......................................................... pag.17

1.4. Fisiopatologia ................................................................ pag.18

1.5. Presentazione clinica e diagnosi ..................... pag.21

1.6. Trattamento ................................................................... pag.22

Capitolo II: Palmitoiletanolamina (PEA)

2.1. Definizione ....................................................................... pag.23

2.2. Biosintesi ed inattivazione .................................... pag.26

2.3. PPARα ...................................................................................... pag.28

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Capitolo III: Studio sperimentale

3.1. Scopo dello studio ...................................................... pag.30

3.2. Materiali e metodi ....................................................... pag.31

3.3. Estrazione proteine e analisi in Western Blot ........................................................................... pag.35

3.4. ELISA per il rilascio di NGF, prostaglandina 2, tripsina e istamina .................. pag.36

3.5. Analisi istochimiche e immunoistochimiche ......................................................... pag.37

3.6. Misurazione dei livelli della PEA nei tessuti umani ........................................................................................... pag.38

3.7. Dati e analisi statistiche ........................................ pag.39

Capitolo IV: Risultati

4.1. Effetto dello stimolo acido sull'attività dei mastociti nel duodeno ........... pag.40

4.2. Effetto dello stimolo acido sull'espressione dei recettori TRPV1 e TRPV4 ..... pag.43

4.3. Rilascio della PEA nei pazienti dispeptici ..... pag.44

4

4.4. Effetto della PEA esogena nei campioni bioptici ........................................................................................ pag.47

4.5. La somministrazione della PEA esogena riduce i sintomi dispeptici .............................................. pag.49

5. Discussione e conclusioni ......................................... pag.55

6. Bibliografia ......................................................................... pag.58

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Riassunto

La dispepsia funzionale (FD), disturbo gastrointestinale caratterizzato da sintomi ricorrenti localizzati nell’epigastrio, è caratterizzata dall’ipersensibilità duodenale all’acido e dall’infiammazione di basso grado della mucosa duodenale. La palmitoiletanolamina (PEA), un composto endogeno rilasciato fisiologicamente nel duodeno, è in grado di modulare la nocicezione e l’infiammazione. Tuttavia, il ruolo della PEA, nella dispepsia funzionale, non è stato valutato.

Obiettivo dello studio

Valutare le vie neuroimmuni coinvolte nelle risposte indotte dall'acido duodenale ex vivo e il ruolo della PEA nella dispepsia funzionale. In particolare, verificare:

• Se un aumento dell’acido, su campioni di biopsia duodenale di pazienti con dispepsia funzionale e soggetti di controllo, è in grado di reclutare e attivare i mastociti (MC) della mucosa.
• Se le risposte indotte dall'acido sovraregolano le fibre che esprimono i recettori TRPV1 e TRPV4, coinvolte nella nocicezione.
• Se il rilascio della PEA endogena è compromesso nei pazienti dispeptici.
• Se la somministrazione della PEA esogena inibisce le risposte indotte dall'acido nei campioni bioptici duodenali di pazienti con dispepsia funzionale attraverso il coinvolgimento di PPARα.
• Se la somministrazione di PEA esogena riduce i sintomi dispeptici.

Valutare pertanto se la PEA può costituire una potenziale strategia terapeutica nella dispepsia funzionale.

Materiali e metodi

Il gruppo sperimentale comprendeva 20 pazienti con diagnosi di dispepsia funzionale (14 femmine; 6 maschi; età media, 42 ± 9,1 anni), secondo i criteri di Roma IV, inviati al nostro centro terziario per un'esofagogastroduodenoscopia (EGDS) diagnostica, dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Federico II e 10 soggetti di controllo (7 femmine; 3 maschi; età media, 45 ± 9,9 anni), sottoposti a esofagogastroduodenoscopia per lo screening del cancro gastrico.

Durante l’endoscopia dei soggetti con dispepsia funzionale e di soggetti di controllo, sono stati raccolti 6 campioni bioptici dalla seconda parte del duodeno e sono stati messi in coltura a pH 3.0 e 7.4. Sono stati valutati: il numero di mastociti (MC), il rilascio dei loro mediatori e l’espressione dei recettori vanilloidi, TRPV1 e TRPV4. I campioni bioptici sono stati incubati a dosi crescenti della PEA.

Dai risultati ottenuti in vitro, successivamente sono stati arruolati 23 pazienti con diagnosi di dispepsia funzionale (16 femmine; 7 maschi; età media 41 ± 8.9 anni) già studiati con EGDS, in cui erano state escluse cause di dispepsia organica, con l’obiettivo di valutare in vivo gli effetti della somministrazione della Palmitoiletanolamide ultra-micronizzata sulla sintomatologia dispeptica.

Risultati

In risposta allo stimolo acido duodenale, è stato osservato un aumento della densità dei mastociti (MC) e delle cellule positive alla triptasi nella mucosa duodenale di tutti i soggetti, sebbene questa risposta è risultata essere amplificata in modo significativo nei pazienti con dispepsia funzionale rispetto al gruppo di controllo (P <0.001 vs controllo). Rispetto ad un pH neutro, l’aumento dell’acido duodenale ha comportato un rialzo complessivo dell'espressione dei recettori TRPV1 e TRPV4, in particolare nei pazienti dispeptici rispetto ai controlli (P<0.001 vs controlli). Inoltre, il rilascio endogeno di PEA, indotto dall’acido, è risultato essere ridotto nella dispepsia funzionale e la sua somministrazione esogena contrasta l’attivazione dei mastociti e l’up-regulation dei recettori TRPV1, (Figura 1).

Figura 1. Pazienti dispeptici e di controllo (Cellular and molecular gastroenterology and hepatology).

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I risultati ottenuti dallo studio osservazionale prospettico dei pazienti affetti da dispepsia funzionale, dopo otto settimane di trattamento con Inibitori di Pompa Protonica (IPP, pantoprazolo 20 mg b.i.d) e dopo otto settimane di trattamento con IPP in associazione alla Palmitoietanolamide ultra-micronizzata, hanno evidenziato un significativo miglioramento della severità dei sintomi rispetto al baseline e un miglioramento evidente con l’associazione PPI + PEA rispetto alla sola terapia con PPI. Inoltre, si è osservata una significativa riduzione degli score totali del PAGI-SYM, rispetto al baseline, sia nel gruppo trattato con PPI, relativo alla severità del “ripienezza post-prandiale”, ma soprattutto nel gruppo trattato con PPI + PEA (p=0.03, p=0.02, rispettivamente), relativo alla severità del “discomfort epigastrico” e “gastric fullness”. Il miglioramento dei sintomi si è osservato anche con una significativa riduzione degli score ottenuti dal PAGI-QoL, dopo il trattamento con IPP in associazione alla Palmitoiletanolamide ultra-micronizzata.

Conclusioni

Si è osservato che l’esposizione del duodeno all’acido avvia una cascata di eventi mediati dai neuroni che culminano nell’attivazione dei mastociti e nell’up-regulation dei recettori TRPV1, conseguenza di un alterato rilascio di PEA endogena. Inoltre, la somministrazione esogena di PEA è stata in grado di contrastare la risposta neuroinfiammatoria in campioni di biopsia duodenale ex vivo di pazienti affetti da dispepsia funzionale e di ridurre i sintomi cardine della dispepsia. La PEA potrebbe essere considerata un’interessante strategia terapeutica per il trattamento della dispepsia funzionale e si spera in futuri studi volti ad analizzare il suo ruolo nella dispepsia e in altri disturbi gastrointestinali.

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Summary

Functional dyspepsia (FD), a gastrointestinal disorder characterised by recurrent symptoms located in the epigastrium, is characterised by duodenal hypersensitivity to acid and low-grade inflammation of the duodenal mucosa. Palmitoylethanolamine (PEA), an endogenous compound released physiologically in the duodenum, is able to modulate nociception and inflammation. However, the role of PEA in functional dyspepsia has not been evaluated.

Aim of the study

To evaluate the neuroimmune pathways involved in duodenal acid-induced responses ex vivo and the role of PEA in functional dyspepsia. In particular, to ascertain:

• Whether an increase in acid, on duodenal biopsy samples from patients with functional dyspepsia and control subjects, is able to recruit and activate mucosal mast cells (MCs).
• Whether acid-induced responses upregulate fibres expressing TRPV1 and TRPV4 receptors, which are involved in nociception.
• Whether endogenous PEA release is impaired in dyspeptic patients.
• Whether administration of exogenous PEA inhibits acid-induced responses in duodenal biopsy specimens from patients with functional dyspepsia through involvement of PPARα.
• Whether administration of exogenous PEA reduces dyspeptic symptoms.

Therefore, we evaluate whether PEA may be a potential therapeutic strategy in functional dyspepsia.

Materials and methods

The experimental group comprised 20 patients with a diagnosis of functional dyspepsia (14 females; 6 males; mean age, 42 ± 9.1 years), according to Rome IV criteria, sent to our tertiary centre for diagnostic oesophagogastroduodenoscopy (EGDS), of the Azienda Ospedaliera Universitaria Federico II, and 10 control subjects (7 females; 3 males; mean age, 45 ± 9.9 years), who underwent oesophagogastroduodenoscopy for gastric cancer screening.

During endoscopy of subjects with functional dyspepsia and control subjects, 6 biopsy samples were collected from the second part of the duodenum and cultured at pH 3.0 and 7.4. The number of mast cells (MC), the release of their mediators and the expression of vanilloid receptors, TRPV1 and TRPV4 were assessed. Biopsy samples were incubated at increasing doses of PEA.

From the results obtained in vitro, 23 patients with a diagnosis of functional dyspepsia (16 females; 7 males; mean age 41 ± 8.9 years) already studied with EGDS, in whom causes of organic dyspepsia had been excluded, with the aim of evaluating in vivo the effects of administration of ultra-micronised palmitoylethanolamide on dyspeptic symptoms.

Results

In response to the duodenal acid stimulus, an increase in mast cell (MC) density and tryptase-positive cells was observed in the duodenal mucosa of all subjects, although this response was significantly amplified in patients with functional dyspepsia compared to the control group (P < 0.001 vs. control). Compared to a neutral pH, increased duodenal acid resulted in an overall increase in TRPV1 and TRPV4 receptor expression, particularly in dyspeptic patients compared to controls (P<0.001 vs. control). Furthermore, endogenous acid-induced PEA release was found to be reduced in functional dyspepsia and its exogenous administration counteracts mast cell activation and TRPV1 receptor up-regulation.

The results obtained from the prospective observational study of patients suffering from functional dyspepsia, after eight weeks of treatment with Proton Pump Inhibitors (PPI, pantoprazole 20 mg b.i.d.) and after eight weeks of treatment with PPI in combination with ultra-micronised Palmitoietanolamide, showed a significant improvement in symptom severity compared to baseline and a clear improvement with the PPI + PEA combination compared to PPI therapy alone. In addition, a significant reduction in the total PAGI-SYM scores, compared to baseline, was observed both in the PPI-treated group, related to the severity of "postprandial repletion", but especially in the group treated with PPI + PEA (p=0.03, p=0.02, respectively), related to the severity of 'epigastric discomfort' and 'gastric fullness'. Improvement in symptoms was also observed with a significant reduction in the scores obtained from the PAGI-QoL after treatment with PPI in combination with ultra-micronised palmitoylethanolamide.

Conclusions

It was observed that exposure of the duodenum to acid initiates a cascade of neuron-mediated events culminating in mast cell activation and up-regulation of TRPV1 receptors, a consequence of altered release of endogenous PEA. In addition, exogenous PEA administration was able to counteract the neuroinflammatory response in ex vivo duodenal biopsy samples from patients with functional dyspepsia and to reduce the pivotal symptoms of dyspepsia. PEA could be considered as an interesting therapeutic strategy for the treatment of functional dyspepsia and future studies are hoped to investigate its role in dyspepsia and other gastrointestinal disorders.

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1. Introduzione

La dispepsia funzionale (FD) è un disturbo gastrointestinale eterogeneo e altamente diffuso, caratterizzato da una pletora di sintomi ricorrenti localizzati nell’epigastrio, in assenza di una causa organica sottostante. 29,30

I criteri di Roma IV hanno riconosciuto due principali sottogruppi di dispepsia funzionale:

• La sindrome da distress post-prandiale (PDS), caratterizzata da sintomi correlati al pasto, come sazietà precoce e pienezza post-prandiale.
• La sindrome da dolore epigastrico (EPS), in cui i sintomi, bruciore o dolore epigastrico, sono principalmente non correlati ai pasti.

Tradizionalmente, lo stomaco era indicato come il principale responsabile della fisiopatologia della dispepsia. Più recentemente, si è verificato un cambiamento di paradigma, con prove sempre più evidenti che dimostrano che i pazienti dispeptici presentano anche anomalie a livello duodenale, tra cui: infiammazione cronica di basso grado (chronic low grade inflammation); aumento della permeabilità della mucosa; aumento della sensibilità della mucosa duodenale a stimoli di natura chimica, quali lipidi e stimoli acidi. 29-35

Tra i meccanismi precedentemente descritti, il ruolo dell'ipersensibilità all’acido è sostenuto dall'evidenza empirica che la soppressione dell'acidità gastrica, mediante inibitori della pompa protonica (IPP) o antistaminici (anti-H2), è efficace nel migliorare i sintomi in un sottogruppo di pazienti con dispepsia funzionale, in particolar modo nei pazienti con EPS, e che sia l'infusione di acido a livello duodenale sia la ritardata clearance dell'acido sono in grado di indurre l’insorgenza di sintomi dispeptici in soggetti sani. 31,36-38

Pertanto, queste evidenze hanno suggerito che la sensibilità duodenale all'acido partecipi alla fisiopatologia della dispepsia funzionale; tuttavia, i potenziali meccanismi alla base di questo fenomeno non sono stati ancora definiti. 38-43

In questo complesso scenario, la palmitoiletanolamide (PEA), una N-aciletanolamina endogena, ritenuta coinvolta in diversi meccanismi protettivi, si è attivata in risposta a stimoli chimici e proinfiammatori. 47-49

La PEA appartiene a un gruppo di lipidi endogeni definiti ALIAmidi (Autacoid Local Injury Antagonist Amides), coinvolti in molti processi fisiopatologici, tra cui l'elaborazione del dolore e l'infiammazione. 48, 50-52

I primi effetti antinfiammatori descritti della PEA, noti come meccanismo ALIA, erano legati principalmente alla sua capacità di modulare l'attivazione e la degranulazione dei mastociti. Inoltre, la PEA è anche un agonista diretto del recettore vanilloide TRPV1 ed è stato ampiamente dimostrato che questo composto mostra un'ampia gamma di effetti antinfiammatori mediati dall'attivazione del recettore attivato dalla proliferazione perossisomiale di tipo alfa (PPARα), un membro della superfamiglia dei recettori nucleari attivati dai ligandi. 53-56

Nella sindrome dell'intestino irritabile (IBS), i livelli plasmatici della PEA più bassi sono risultati associati in modo significativo al dolore addominale più severo. Ad oggi, non è ancora stato indagato se la PEA sia coinvolta nella fisiopatologia della dispepsia funzionale. 57

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Capitolo I: Dispepsia funzionale

1.1. Definizione

La dispepsia, dal greco δυς (Dys-) che significa “difficile” e “πɛ ψη” (Pepto) che vuol dire “digestione”, è una sindrome clinica caratterizzata dalla presenza di sintomi cronici o ricorrenti, da almeno due mesi in base ai criteri di Roma IV, che includono dolore e/o bruciore epigastrico, sensazione di ripienezza post-prandiale, gonfiore epigastrico, sazietà precoce, nausea, vomito ed eruttazione (Figura 2).