Determinazione di Nuovi oppioidi sintetici in matrice cheratinica mediante UPLC-MSMS

Università degli Studi di Verona

Università degli Studi di Verona

Laurea Triennale in Biotecnologie (L2)

Dipartimento di Diagnostica e Sanità Pubblica

Sezione di Medicina Legale

Determinazione di nuovi oppioidi sintetici in matrice cheratinica mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa

Laureanda: Anna Bacci VR458535

Relatore: Prof. Vettori Andrea

Correlatore: Prof.ssa Gottardo Rossella

Anno 2022/2023

Sommario

• 1 Introduzione .......................................................................................................................... 1
• 1.1 NSO: nuovi oppioidi sintetici .......................................................................................................... 4
• 1.1.1 Fentanyl e suoi derivati ....................................................................................................................................... 6
• 1.1.2 Nitazeni ..................................................................................................................................... 7
• 1.1.3 Xylazina ..................................................................................................................................... 8
• 1.2 Analisi del capello in tossicologia forense .................................................................................. 10
• 1.3 LC-MS/MS ............................................................................................................................................................................................................................ 11
• 1.3.1 SPE: Solid Phase Extraction .................................................................................................................................. 12
• 1.4 Scopo
• 2 Materiali e metodi .............................................................................................................. 13
• 2.1 Soluzioni standard e reagenti .................................................................... 13
• 2.2 Strumentazione e condizioni analitiche .............................................................................................. 15
• 2.3 Preparazione dei campioni
• 3 Validazione del metodo .................................................................................................. 17
• 3.1 Sensibilità ......................................................................................................................... 17
• 3.2 Accuratezza (bias) ........................................................................................................... 18
• 3.3 Precisione .......................................................................................................................... 18
• 3.4 Linearità ........................................................................................................................... 19
• 3.5 Carry-over (trascinamento) ......................................................................................... 20
• 3.6 Selettività o specificità ................................................................................................. 20
• 3.7 Effetto matrice e recupero estrattivo ............................................................................................ 21
• 3.8 Stabilità ............................................................................................................................ 22
• 4 Risultati e discussione ..................................................................................................... 23
• 4.1 Ottimizzazione UPLC-MS/MS ......................................................................................... 23
• 4.2 Validazione ....................................................................................................................... 25
• 4.2.1 Precisione e accuratezza ................................................................................................................................... 25
• 4.2.2 Linearità ............................................................................................................................... 26
• 4.2.3 Carry-over ................................................................................................................................ 27
• 4.2.4 Selettività ................................................................................................................................ 28
• 4.2.5 Valutazione dell’effetto matrice e del recupero estrattivo ........................................................ 28
• 4.2.6 Sensibilità (LOD e LLOQ) ....................................................................................................... 29
• 4.2.7 Stabilità .................................................................................................................................... 29
• 4.3 Analisi dei campioni reali ............................................................................................... 29
• 5 Conclusioni .............................................................................................................................. 36
• 6 Riferimenti ............................................................................................................................ 37

1 Introduzione

L’uso inappropriato e abuso di oppioidi sintetici è un fenomeno che si è sviluppato dagli inizi degli anni ’90 e si è manifestato ancor più con il verificarsi della pandemia di SARS-Cov2 (Sameer Imtiaz, 2021).

Nel corso degli ultimi decenni si sono verificate diverse epidemie da oppioidi. La prima avvenne negli anni ‘90 ed era legata all’abuso di oppioidi da prescrizione, quali metadone, oxicodone e idrocodone. Nel 1995 l’American Pain Society aveva iniziato una campagna per il trattamento e controllo del dolore, sostenuta da varie agenzie nazionali e federali, portando il Congresso degli Stati Uniti riunito nel 2000 a dichiarare lo stesso anno come inizio del “Decennio del controllo del dolore” (Darnall et al, 2019). I morti per overdose da oppioidi iniziarono ad aumentare.

La seconda epidemia di overdosi invece risale al 2010 ed è legata prevalentemente al consumo di eroina; mentre la terza, che ha avuto inizio nel 2013 e che perdura fino ad oggi, ha avuto come principali protagonisti tramadolo e fentanyl (SIF, 2018).

Nonostante le restrizioni legate alle normative vigenti, la possibilità di acquistare sostanze tramite dark web ha facilitato la diffusione dell’uso di sostanze psicoattive. Questo fenomeno è aumentato in particolare durante il periodo pandemico, quando il confinamento domiciliare ha incrementato la richiesta di consumo di sostanze in solitudine, come oppiacei, nuovi oppioidi sintetici e le nuove benzodiazepine.

In particolare negli USA, in corrispondenza della pandemia da Covid, si è registrato un aumento esponenziale dei decessi per overdose da queste sostanze determinando una grande preoccupazione nel Dipartimento Statunitense della Salute e dei Servizi Umani, il quale ha dichiarato che la crisi degli oppioidi è un’emergenza sanitaria pubblica nazionale (Ghose R., 2022).

In anni recenti, l’Osservatorio europeo delle droghe e delle tossicodipendenze (EMCDDA), di concerto con l’FDA e la National Academy of Medicine, ha elaborato delle normative per ridurre il rischio di dispersione dei farmaci dall’uso appropriato (AIFA, 2016). Al fine di diminuire il numero di prescrizioni di oppioidi per trattare dolore acuto o cronico non oncologico sono state redatte delle linee guida per la terapia con oppioidi che prevedono, oltre alla formazione dei medici prescrittori, anche l’offerta di terapie alternative (Jason W. Busse, 2017).

Nel caso sia invece necessario trattare i pazienti con gli oppioidi si raccomanda di valutare attentamente il farmaco migliore in base alla casistica considerando il dosaggio, la durata, la valutazione dei progressi e un’eventuale interruzione. Si esorta il monitoraggio dei pazienti (CDC, 2016).

Già il medico alchimista svizzero Paracelso con la sua massima “Sola dosis venenum facit”, ossia è la dose che fa il veleno, aveva compreso che una sostanza per quanto utile può ragionevolmente essere tossica se la dose assunta è maggiore della dose-soglia sopportabile per l’organismo.

Secondo i dati e grafici riportati dall’NIH (NIH), numericamente parlando, nel 2021 sono stati segnalati circa 106.000 morti per overdose di droga negli Stati Uniti, sia per droghe illecite che per oppioidi da prescrizione. Di questi, 70.601 sono dovuti ad oppioidi sintetici tra cui principalmente fentanyl. Vi è stato un aumento di 7.5 volte nel 2021 rispetto al 2015.

Se confrontiamo l’andamento dal 1999 al 2021 nella figura 1, si registra un aumento esponenziale delle overdosi sostenute dall’assunzione di oppioidi, in particolare dal 2014 (https://nida.nih.gov/sites/default/files/Overdose_data_1999-2021%201.19.23.xlsx).

USA drug-involved overdoses death

120000

100000

80000

60000

40000

20000

0

Total overdoses death

Presence of xylazine

Synthetic Opioids other than Methadone (primarily fentanyl)

Figura 1: National Drug-Involved Overdoses Death, fonte NIH, CDC e DEA.

Il fentanyl, in particolare, ha causato molte morti sia se assunto singolarmente sia come adulterante di altre droghe, quali l’eroina. Gli adulteranti sono additivi aggiunti nelle preparazioni illecite di sostanze stupefacenti per migliorarne le proprietà psicoattive oppure per ridurne il costo. Spesso gli adulteranti aumentano la pericolosità delle sostanze stupefacenti con effetti tossici spesso fatali. Tra gli adulteranti più comuni si ricordano il fentanyl per l’eroina e il levamisolo per le polveri di cocaina.

Tra gli adulteranti riscontrati più recentemente, il Dipartimento di Giustizia statunitense ha espresso preoccupazione verso la xylazina. La xylazina è un farmaco veterinario di cui è stato segnalato l’uso come adulterante nelle preparazioni illecite di eroina e fentanyl. Questa molecola sembra essere responsabile di numerose morti per overdose negli Stati Uniti (Joseph Friedman, 2021).

La percentuale di casi di decesso in cui era riscontrata la presenza di xylazina è passata dal 0.36% del 2015, fino al 6.7% nel 2020 (Joseph Friedman, 2021). Secondo un report della NVSS Vital Statistics Rapid Release (Merianne Rose Spencer, 2023, p. 6) basato sui dati del National Center for Health Statistics, nel 2018 vi sono state 102 overdosi che presentavano positività alla xilazina, nel 2019 rispettivamente 627, nel 2020 invece 1499 e nel 2021 si ha avuto un aumento fino a 3468.

La causa di morte per overdose da oppioidi come fentanyl e derivati è data dalla depressione respiratoria che comporta rigidità della parete toracica e delle vie aeree, portando il soggetto che ha assunto dosi elevate, o oltre il limite di tossicità, alla morte. Agendo quindi sul tronco encefalico queste sostanze riducono la frequenza e profondità respiratoria e conseguentemente progredendo fino all’apnea e alla morte.

Solitamente nel caso di oppiacei si può invertire la condizione di depressione respiratoria assumendo un antidoto noto come Naloxone, che agisce antagonizzando i recettori oppioidi µ in modo competitivo. Può essere somministrato per via endovenosa, via muscolare, via sottocutanea o in forma di spray nasale (Handal, 1983).

1.1 NSO: nuovi oppioidi sintetici

I nuovi oppioidi sintetici (NSO) sono sostanze psicoattive che sono annoverate tra le NPS (Novel Psychoactive Substances). Le NPS sono sostanze chimiche sintetizzate sia in laboratori clandestini sia in laboratori di chimico-farmaceutica come intermedi, come nuove molecole ma strutturalmente e farmacologicamente simili a droghe già esistenti.

Esse mimano gli effetti psicoattivi delle droghe vietate, sono quindi a tutti gli effetti sostanze d’abuso. Tuttavia, non sono sotto il controllo della Convenzione Unica sugli Stupefacenti del 1961 e della Convenzione delle Sostanze Psicotrope del 1971. Di conseguenza non sono inserite nella tabella delle sostanze illegali costituendo così una minaccia per la salute pubblica. Oppure, anche se inserite nella lista subito vengono prodotti analoghi sostituti legali. Ogni anno vengono create e poi identificate numerose nuove NPS, alcune diventano diffuse e ampiamente consumate, altre invece dimenticate perché non utilizzate (UNODC, 2022).

Gli oppioidi sintetici agiscono mediante interazione coi recettori del recettore oppioide µ. L’attivazione stimola lo scambio di GTP con GDP sul complesso della proteina G e in seguito inibisce l'adenilato ciclasi. Questo provoca una diminuzione dell’AMP ciclico intracellulare che inibisce l'afflusso di calcio mediato da cAMP nella cellula attraverso i canali del calcio e quindi si traduce in iperpolarizzazione e ridotta eccitabilità neuronale. L’effetto complessivo è l’induzione di analgesia, ma si verifica anche la depressione respiratoria che può essere fatale.

1.1.1 Fentanyl e suoi derivati

Il fentanyl è un potente analgesico narcotico sintetico e anestetico locale disponibile in terapia per il trattamento del dolore severo.

Il fentanyl è stato preparato per la prima volta da Paul Janssen nel 1959 nell’ambito di un brevetto tenuto dalla sua società, la Janssen Pharmaceutica. Nel 1968 l’FDA ne autorizzò l’uso come anestetico-sedativo poiché la sua potenza è da 50 a 100 volte più potente di quello della morfina.

La formula chimica è C₂₂H₂₈N₂O dal peso molecolare di 336.5 g/mol.

Dal punto di vista chimico, si tratta di un’ammide di acido monocarbossilico ottenuta dalla condensazione dell’N-fenil-1-(2-feniletil)piperidin-4-ammina con l’acido propanoico. Per questo viene infatti definito come agonista oppioide fenilpiperidinico (Fig. 2).

Figura 2: Struttura chimica del Fentanyl, da ChEBI.

Il fentanyl è un agonista del recettore µ-oppioide del SNC che imita gli effetti degli oppiacei endogeni. Viene usato per la terapia del dolore, per trattare pazienti con dolore oncologico o in anestesia.

Si presenta come una polvere bianca granulare o cristallina, da cui vengono prodotte pasticche per uso orale o anche cerotti transdermici. Può essere assunto tramite via endovenosa, o per via intranasale. Il fentanyl in forma illegale si presenta come una polvere gialla o come trip di carta (sottili pezzettini di cartoncino impregnati di fentanyl).

Fondamentale è il rispetto del dosaggio. Per l’effetto analgesico viene raccomandata una concentrazione sierica pari a 1-2 ng/ml di fentanyl, mentre per l’anestesia dai 10 ai 20 ng/ml (EMCDDA).

Vi possono essere delle reazioni collaterali come nausea, capogiri, vomito, affaticamento, mal di testa, costipazione, anemia ed edema periferico. Per concentrazioni superiori a quelle raccomandate si può andare incontro a overdose data dalla depressione respiratoria, regredibile comunque con il naloxone. Si può anche andare incontro ad arresto cardiaco o grave reazione anafilattica (Ministero dell’interno).

Negli esseri umani 250 µg di fentanil sono sufficienti per provocare il decesso (Ellenhorn, 1988).

Vi sono numerosi analoghi derivanti dal fentanyl. Essi differiscono nella modifica sostitutiva di gruppi chimici come riportato in Figura 3.

Figura 3: Struttura chimica analoghi del fentanyl, da www.research gate.net.

1.1.2 Nitazeni

I Nitazeni sono oppioidi benzimidazolici derivanti dal 2-benzilbenzimidazolo, sintetizzati a partire dagli anni ’50 come oppioidi sintetici (Roberts, 2022). Sono stati creati dalla casa farmaceutica svizzera CIBA (Maria Antonietta De Luca, 2022). Anche i nitazeni agiscono sui recettori µ-oppioidi. Essi producono un effetto antinocicettivo superiore, anche di mille volte, rispetto sia alla morfina che al fentanyl (Marthe M. Vandeputte, 2021), ma hanno una durata di azione minore.

Negli ultimi anni sono comparsi nel mercato illegale differenti analoghi o derivati, tra cui: metonitazene, metodesnitazene, etonitazene, etodesnitazene, protonizatene, butonitazene, isotonitazene, clonitazene, flunitazene N-piperidinil etonitazene, N-piperidino etonitazene.

Essi fanno parte di una classe di sostanze che contengono un anello benzimidazolico con l’etilammina in posizione 1 e un gruppo benzilico in posizione 2 (Administration, 2022). In Figura 4 si riporta la struttura chimica dei nitazeni e i differenti analoghi.

Figura 4: Struttura chimica dei nitazeni e derivati, da Cayman Chemical (2021).

Nonostante essi siano stati creati per essere una alternativa valida e sicura alla morfina, per i loro rischi e per la mancanza di una terapia clinicamente approvata non sono stati introdotti nel mercato. Ad oggi solo l’etonitazene e il clonitazene sono stati inseriti nella tabella I della Convenzione Unica sugli Stupefacenti del 1961 (Nations, 1961).

L’overdose induce depressione respiratoria, in seguito all’assunzione consapevole o meno di questo gruppo di sostanze, è inoltre reversibile con il naloxone ma probabilmente sono necessarie più dosi dell’antidoto per riuscire ad evitare la morte del soggetto.

I vari analoghi, non essendo stati inseriti nella tabella I (ad eccezione di quelli sopra citati), non sono stati tenuti sotto controllo, finché nel febbraio del 2020 grazie ai dati resi disponibili dal CDC sono stati trovati numerosi casi tossicologici di overdose da oppioidi con positività a questa classe di NPS benzimidazolici (EMCDDA, 2020).

Anche i nitazeni hanno u