C3G nella regolazione cellulare: un possibile target terapeutico per Glioblastoma

Università degli studi del Sannio

Dipartimento di Scienze e Tecnologie

Corso di Laurea in Biotecnologie

Tesi di Laurea in Biologia Molecolare

“La proteina C3G nella regolazione cellulare: un possibile target terapeutico per Glioblastoma”

Relatore: Candidata:

Ch.mo Prof Marina Ala

Massimo Pancione Matr. 171003535

Correlatore:

Ch.mo Prof Álvaro Gutiérrez-Uzquiza

Anno accademico 2022/2023

Indice

Indice ................................................................................................................................. 1

Introduzione .................................................................................................................... 2

Capitolo primo - La segnalazione cellulare ..................................................................... 3

1.1 Meccanismi di segnalazione: principi generali ........................................................ 3

1.2 I recettori RTK: oligomerizzazione per riconoscimento del ligando ....................... 5

1.3 I domini SH2 e SH3 ................................................................................................. 7

1.3.1 Src Homology domain 2 8..........................................................................................

1.3.2 Src Homology domain 3 9..........................................................................................

1.3.3 I domini SH2 e SH3 nella regolazione cellulare 11....................................................

1.4 Oncogeni e Oncosoppressori .................................................................................. 13

1.4.1 La proteina Crk 15......................................................................................................

Capitolo secondo - I controllori della segnalazione ................................................... 17

2.1 Regolazione da GTPasi .......................................................................................... 17

2.2 Proteine GAP e proteine GEF ................................................................................ 17

2.2.1 Le GTPasi Ras 19.......................................................................................................

2.2.2 La via delle MAPK 20................................................................................................

2.3 La proteina C3G ..................................................................................................... 22

2.3.1 C3G nei sistemi di segnalazione 23............................................................................

L’importanza di C3G

Capitolo terzo - ......................................................................... 26

3.1 C3G nel tessuto nervoso ......................................................................................... 26

3.2 Il Glioblastoma ....................................................................................................... 28

3.2.1 Perché il GBM è così invasivo? 30.............................................................................

3.2.2 Ruoli di C3G nel glioblastoma 33..............................................................................

Conclusioni - Implicazioni Cliniche e Prospettive Terapeutiche ................................... 37

Bibliografia .................................................................................................................... 39

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Introduzione

Il presente elaborato ha lo scopo di mostrare come difetti nei sistemi di segnalazione possano contribuire allo sviluppo di forme tumorali e come si possano, attraverso studi di caratterizzazione dei fattori coinvolti, sviluppare strategie terapeutiche mirate. Fra i tumori più difficili da trattare si colloca il glioblastoma multiforme (GBM), il tumore ad oggi più letale, a causa del grande numero di interattori interessati e dell’alto grado di invasività delle cellule cancerose, che rendono complicato sviluppare tecniche di trattamento personalizzate. C3G è una proteina dal ruolo chiave nel GBM. Essa è implicata in una vasta rete di funzioni, dipendenti e non dalla sua attività come regolatore della segnalazione, nella quale interagisce con proteine di superficie, come i recettori RTK, con effettori downstream, come la proteina Rap1, e con molti fattori coinvolti in vie di segnalazione a cascata, come quella delle MAPK. Attraverso l’analisi di studi in merito, quindi, questo elaborato sostiene la tesi dei gruppi di ricerca del Dipartimento di Biochimica dell’Università Complutense di Madrid, da cui si è adottato l’argomento di studio, secondo cui la proteina C3G può diventare un bersaglio chiave nel trattamento del glioblastoma multiforme, in seguito a una più approfondita e necessaria caratterizzazione dei meccanismi descritti.

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1. Capitolo primo - La segnalazione cellulare

1.1 Meccanismi di segnalazione: principi generali

Nonostante sembrino tendere alla perfezione funzionale, spesso i meccanismi di segnalazione contribuiscono allo sviluppo di forme tumorali. Questo accade a causa della grande complessità delle vie di trasduzione del segnale, reti che descrivono le interdipendenze funzionali tra distinte classi di molecole, che determinano collettivamente la risposta di una specifica cellula ai suoi segnali afferenti. 1

Un sistema complesso quale un organismo pluricellulare richiede una costante comunicazione cellula-cellula, che si attua con lo scambio di molecole segnale che veicolano l’informazione. Alcune di queste molecole agiscono su lunghe distanze, inviando segnali a cellule molto lontane; altre, invece, contattano solo cellule limitrofe.

I meccanismi di segnalazione differiscono per la tipologia di informazione da trasmettere e per i relativi messaggeri coinvolti. In tutti i casi, però, la ricezione del segnale avviene per riconoscimento, da parte di una proteina recettoriale, di una molecola specifica, che può condurre, tramite cambiamenti nella cellula, all’attivazione o inibizione di una via cellulare di interesse (Figura 1.1). 2

1 Ochsner, S.A., Abraham, D., Martin, K. et al. The Signaling Pathways Project, an integrated ‘omics knowledgebase for mammalian cellular signaling pathways. Sci Data 6, 252 (2019). https://doi.org/10.1038/s41597-019-0193-4

2 (Bruce Alberts 2009, cap. 15 p. 867)

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Ciò avviene per l’intervento, a seguito dell’attivazione di un recettore, di proteine di segnalazione intracellulari, capaci di elaborare il segnale recepito dalla cellula e di distribuirlo agli specifici bersagli a valle delle vie di segnalazione, che sono anche detti proteine effettrici. A seconda della tipologia di segnale e dello stato della cellula ricevente, gli effettori possono agire, poi, come regolatori della trascrizione, canali ionici, componenti di una via metabolica o parti del citoscheletro.

I sistemi di segnalazione, quindi, veicolano un’informazione precisa, per mezzo di pathway interconnesse, che costruiscono una complessa rete di trasmissione, capace di amplificare il segnale da riportare, tramite ramificazioni a valle della via (Figura 1.2). In alcuni casi la ramificazione può anche permettere a un segnale di modulare la forza di una risposta ad altri segnali, con l’intervento, ad esempio, dei sistemi a feedback.

Figura 1.1: Il legame di una molecola segnale a un recettore transmembrana attiva il meccanismo di trasduzione del segnale.

3 (Bruce Alberts 2009, cap. 15, p. 917)

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Figura 1.2: Rappresentazione semplificata dell’interconnessione di cinque vie parallele di segnalazione, attivate da recettori accoppiati a proteina G (GPCR) e da recettori tirosina-chinasi (RTK).

1.2 I recettori RTK: oligomerizzazione per riconoscimento del ligando

I recettori si distinguono in recettori di superficie, che riconoscono ligandi idrofili, e recettori con localizzazione intracellulare, capaci di legare molecole sufficientemente piccole e idrofobiche per attraversare la membrana plasmatica. I recettori di superficie, in particolare, agiscono da trasduttori del segnale, convertendo il legame di un ligando extracellulare in segnali intracellulari che alterano il comportamento della cellula (Bruce Alberts 2009).

Alla classe dei recettori di superficie appartengono i recettori RTK con attività tirosina-chinasica (RTK), proteine dimeriche integrali di membrana, costituite da un dominio extracellulare, di legame alla proteina segnale, e un dominio tirosina-chinasi sul lato citosolico (Figura 1.3). 4

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In assenza dei segnali extracellulari, il recettore RTK è in forma monomerica, con il dominio chinasi inattivo. Il legame al ligando provoca nel recettore un cambiamento conformazionale, che unisce i due monomeri per formare un dimero, il che conduce, nella maggior parte dei casi, i due domini chinasici a fosforilarsi a vicenda su tirosine specifiche, con completa attivazione della proteina.

Da ciò scaturisce una vera e propria catena di fosforilazione di tirosine, che genera siti di attracco per proteine di segnalazione intracellulari, le proteine adattatrici, con formazione di complessi proteici (Figura 1.4), che permettono di trasdurre, modulare e amplificare i segnali lungo vie di segnalazione multiple (Bruce Alberts 2009).

I meccanismi di dimerizzazione variano molto tra i diversi membri della famiglia degli RTK, fra cui si ricordano il recettore dell’insulina (IGF1R), quello del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR) e il recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGFR).

4 (Lemmon e Schlessinger 2010)

5 (Bruce Alberts 2009, 906)

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Figura 1.3: Attivazione del recettore per dimerizzazione indotta dal ligando. Le proteine di segnalazione legate alle fosfotirosine (“P” sul recettore) fanno da impalcatura per la trasmissione a valle.

Figura 1.4: Formazione di multi-complessi proteici per segnalazione da RTK.

1.3 I domini SH2 e SH3

La formazione dei grandi complessi proteici sulla coda citoplasmatica di un recettore RTK è una strategia semplice ed efficace per aumentare la specificità delle interazioni tra le molecole segnale, assicurando che esse interagiscano solo con proteine designate. L’assemblaggio di tali complessi di segnalazione dipende da domini di interazione altamente conservati, come i domini SH2 e SH3 (Bruce Alberts 2009).

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1.3.1 Src Homology domain 2

I domini SH2 (Src Homology-domain 2) sono stati scoperti nella proteina tirosina chinasi Src, caratterizzata a partire dall’oncogene virale v-Src, causa del “sarcoma di Rous”, e sono stati così denominati per l’omologia strutturale con la Src (Waksman G. 1992).

La struttura dei domini SH2 è costituita da circa 100-120 amminoacidi e comprende tre regioni principali (Figura 1.5, (Waksman G. 1992)):

• Α-elica N-terminale: regione coinvolta nel riconoscimento e nel legame con il residuo di fosfotirosina del peptide bersaglio.
• Β-sheet centrale: core idrofobico di circa 5-6 foglietti β antiparalleli, che formano una tasca per accogliere il residuo di fosfotirosina.
• Α-elica C-terminale: coinvolta nel riconoscimento del legame con altre regioni del peptide bersaglio e nel posizionamento del dominio SH2 sulla proteina da riconoscere.

Nonostante la peculiarità strutturale per il riconoscimento di amminoacidi specifici, comunque, si è scoperta la presenza di domini SH2 anche in proteine funzionalmente non correlate alle tirosina-chinasi, come la fosfatidil inositolo 3-OH chinasi, la fosfolipasi Cγ1, le proteine Ras-GAP e anche in alcune proteine tirosina-fosfatasi (Waksman G. 1992).

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Figura 1.5: Disegno schematico del dominio SH2 di Src. Le frecce indicano foglietti-β e i rettangoli le α-eliche.

1.3.2 Src Homology domain 3

Come i domini SH2, anche i domini SH3 sono coinvolti nei meccanismi di mediazione della segnalazione cellulare, e anche loro derivano il nome dall’omologia, nelle regioni N-terminali, con la proteina Src.

Essi sono strutturalmente e funzionalmente distinti dai domini SH2, in quanto costituiti da circa 60 residui, che formano una struttura caratteristica a barile-β, comprendente 5 foglietti β antiparalleli disposti come le “doghe” di un barile; le estremità, invece, si estendono a formare una tasca idrofobica (Figura 1.6, (Musacchio A. 1992)).

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La tasca è circondata da loop che riconoscono e legano specificamente il motivo “PxxP” nei peptidi bersaglio, dove “P” è un residuo di prolina e “x” è un amminoacido qualsiasi.

Considerando che circa il 25% delle proteine umane ospita regioni ricche di prolina, è incredibile come le centinaia di domini SH3 codificate dal genoma umano selezionino specificamente i loro partner fisiologici (Kaneko T. 2008). A questo dilemma, inoltre, si aggiunge la scoperta che alcuni domini SH3 sono in grado di legare non solo i motivi PxxP, ma anche variazioni di tale sequenza consenso e di instaurare persino interazioni fra le strutture terziarie (Li 2005).

Proprio per la capacità di contattare numerosi motivi proteici, quindi, le funzionalità dei domini SH3 risultano essere numerose, ma evidenziano il loro coinvolgimento principale nello stabilire interazioni proteina-proteina, fondamentali per la formazione di complessi proteici, e nel coordinamento di processi cellulari come la segnalazione, l’adesione e la motilità cellulare (Musacchio A. 1992).

Figura 1.6: Rappresentazione schematica di un dominio SH3. Le frecce indicano i foglietti-β e il cilindro l’α-elica.

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1.3.3 I domini SH2 e SH3 nella regolazione cellulare

Alcune proteine di segnalazione sono composte quasi interamente da domini SH2 e SH3, come accade nella proteina Crk, e funzionano da adattatori, permettendo il collegamento fra i residui di fosfotirosina sugli RTK e proteine che non hanno domini SH2 propri.

La segnalazione da recettori RTK attivati, pertanto, può muoversi in avanti proprio grazie alla mediazione di domini come gli SH2 e SH3, che trasmettono