Esercizi tecnologia del DNA

Equivalenze fra unità di misura

Peso e volume

Peso g mg µg ng pg

Volume l ml µl nl pl

10 g = µg?

10 g = 10 x 10⁶ µg

3 ng = µg?

3 ng = 3 10^-3 µg

5 ng = pg?

5 ng = 5 10³ pg

Concentrazione

Concentrazione = Peso / Volume

40 mg/ml = µg/ml? = µg/µl?

40 mg/ml = 40 10³ µg/ml = 40 10³ µg/10³ µl = 40 µg/µl

3 ng/µl = µg/µl? = µg/ml?

3 ng/µl = 3 10^-3 µg/µl = 3 10^-3 µg/10^-3 ml = 3 µg/ml

0.5 pg/µl = µg/ml?

0.5 pg/µl = 0.5 10^-6 µg/µl = 0.5 10^-6 µg/10^-3 ml = 0.5 10^-3 µg/ml

Concentrazione molare di un DNA di 300 pb

Una soluzione di un DNA di 300 pb ha una concentrazione di 15 µg/µl. Qual è la sua concentrazione molare?

PM medio di una coppia di basi è 660 Da

Quantità in moli = Peso (g) / Peso Molecolare (Da)

PM (300bp) = 300 x 660 Da = 198000 Da = 198 kDa

µmoli del DNA da 300bp = 15 µg / 198000 = 7.6 10^-5

15 µg/µl corrisponde per questo DNA a 7.6 10^-5 µmoli/µl

Trasformata in Molarità cioè moli/litro

7.6 10^-5 µmoli = 7.6 10^-5 x 10^-6 moli = 7.6 10^-11 moli

7.6 10^-5 µmoli/µl = 7.6 10^-11 moli / 10^-6 l

Equivalenze fra unità di misura

Peso e volume

Peso

Volume

10 g = µg?

10 g = 10 x 10⁶ µg

3 ng = µg?

3 ng = 3 10^-3 µg

5 ng = pg?

5 ng = 5 10³ pg

Concentrazione

Concentrazione = Peso / Volume

40 mg/ml = µg/ml? = µg/µl?

40 mg/ml = 40 10³ µg/ml = 40 10³ µg/10³ µl = 40 µg/µl

3 ng/µl = µg/µl? = µg/ml?

3 ng/µl = 3 10^-3 µg/µl = 3 10^-3 µg/10^-3 ml = 3 µg/ml

0.5 pg/µl = µg/ml?

0.5 pg/µl = 0.5 10^-6 µg/µl = 0.5 10^-6 µg/10^-3 ml = 0.5 10^-3 µg/ml

Concentrazione molare di un DNA di 300 pb

Una soluzione di un DNA di 300 pb ha una concentrazione di 15 µg/µl. Qual è la sua concentrazione molare?

PM medio di una coppia di basi è 660 Da

Quantità in moli = Peso (g) / Peso Molecolare (Da)

PM (300bp) = 300 x 660 Da = 198000 Da = 198 kDa

µmoli del DNA da 300bp = 15 µg / 198000 = 7.6 10^-5

15 µg/µl corrisponde per questo DNA a 7.6 10^-5 µmoli/µl

Trasformata in Molarità cioè moli/litro

7.6 10^-5 µmoli = 7.6 10^-5 x 10^-6 moli = 7.6 10^-11 moli

7.6 10^-5 µmoli/µl = 7.6 10^-11 moli / 10^-6 l

Molecole di DNA in soluzione

Una soluzione di un DNA di 300 pb ha una concentrazione di 15 μg/μl. Quante molecole di questo DNA sono contenute in 5 μl di tale soluzione

Concentrazione = Peso / Volume

Peso = Conc. x Vol.

Peso = 15 μg/μl x 5 μl = 75 μg

Quantità in moli = Peso / Peso Molecolare

PM (300bp) = 300 x 660 Da = 198000 Da = 198 kDa

μmoli del DNA da 300bp = 75 μg / 198000 = 3.8 x 10^-4

Numero di Avogadro: 1 mole contiene 6.022 x 10²³ molecole

3.8 x 10^-4 μmoli = 3.8 x 10^-4 x 10^-6 moli = 3.8 x 10^-10 moli

3.8 x 10^-10 moli x 6.022 x 10²³ molecole/mole = 2.29 x 10¹⁴ molecole

5 μl di tale soluzione contengono 2.29 x 10¹⁴ molecole di DNA

Digestione di DNA circolare

Quanti tipi di molecole si formano dopo digestione di una molecola di DNA circolare contenente due siti di restrizione?

Enzima di restrizione EcoRI (GAATTC)

L’efficienza di restrizione non è mai al 100%

5 μl di una soluzione di un DNA di 300 pb ha una concentrazione di 15 μg/μl.

75 μg

2.29 x 10¹⁴ molecole

μmoli del DNA = 3.8 10^-4

Digestione completa con EcoRI (GAATTC)

Quante molecole di 75bp e 225bp si produrranno?

2.29 x 10¹⁴ molecole

2.29 x 10¹⁴ molecole

Quante moli di 75bp e 225bp si produrranno?

3.8 10^-4 μmoli

3.8 10^-4 μmoli

Quante μg di 75bp e 225bp si produrranno?

3.8 10^-4 μmoli x PM_75bp

3.8 10^-4 μmoli x PM_225bp

18.75 μg

56.25 μg

Peso totale 75 μg

Variazione del volume e concentrazione

100 μl di una soluzione di DNA alla concentrazione di 10 μg/μl

V_i = 100 μl

C_i = 10 μg/μl

Di quanto dobbiamo ridurre il volume per avere una soluzione alla concentrazione di 40 μg/μl?

V_f = ? μl

C_f = 40 μg/μl

C = P / V

P = C x V

Di quanto dobbiamo aumentare il volume per avere una soluzione alla concentrazione di 0.2 μg/μl?

V_f = ? μl

C_f = 0.2 μg/μl

P_i = C_i x V_i

Aggiungere o togliere H₂O

P_f = C_f x V_f

P_i = P_f

C_i x V_i = C_f x V_f

10 μg/μl x 100 μl / 40 μg/μl = V_f? μl

μl = 10 x 100 / 0.2 = 5000

V_H2O = - 75 μl

V_H2O = + 4900 μl

Diluizione da soluzione stock di DNA

Una soluzione stock di DNA ha la concentrazione di 25 μM

Ci = 25 μM

Quanti μl soluzione stock dobbiamo prelevare per preparare 1 ml di soluzione a 2.5 μM ? Quanta H₂O dobbiamo aggiungere?

Vf = 1000 μl

Cf = 2.5 μM

C = P / V

P = C x V

Pi = Ci x Vi

Ci x Vi = Cf x Vf

25 μM x ? μl = 2.5 μM x 1000 μl

μl = 2.5 x 1000 / 25 = 100

V H₂O = 900 μl

Quanti μl soluzione stock dobbiamo prelevare per preparare 150 μl di soluzione a 20 nM ? Quanta H₂O dobbiamo aggiungere?

Vf = 150 μl

Cf = 20 nM = 0.02 μM

Pi = Pf

Pi = Ci x Vi

Pf = Cf x Vf

25 μM x ? μl = 0.02 μM x 150 μl

μl = 0.02 x 150 / 25 = 0.12

V H₂O = 150 – 0.12 = 149.88 μl

Fattore di diluizione

Fattore di diluizione (X= F_dil) = Ci/Cf = Vf/Vi   Vf/Vi = F_dil

Vi = Vf / F_dil = Vf / X

Concentrazione dello sciroppo di amarena è 5X

Per farmi 1 l di bibita decente (non troppo dolce né troppo slavata) cosa devo fare?

200 ml di sciroppo 5X + 800 ml di acqua = 1000 ml

1000 ml / 5X = 200 ml

Concentrazione del tampone A è 20X

Per farmi 150 ml di tampone alla contrazione ottimale cosa devo fare?

150 ml / 20X = 7.5 ml

150 ml - 7.5 ml = 142.5 ml di H₂O

• A 250 ml H₂O quanto tampone (V_tamp) alla contrazione 20X devo aggiungere per avere la concentrazione ottimale?

V_tamp = V_finale / 20X   V_finale = 20 * V_tamp

V_finale - V_tamp = 250 ml di H₂O   20 * V_tamp - V_tamp = 250 ml

19 * V_tamp = 250 ml   V_tamp = 250/19 = 13.2 ml di tampone

V_tamp = V_finale/20X   V_tamp = V_H2O/20X-1

• Quanto gel loading buffer 6X dobbiamo aggiungere a 15μl di DNA in H₂O ?

Es. 15μl di DNA in H₂O

15μl di DNA in H₂O / (6X-1) = 15/5 = 3 μl

18μl totali

Campione da caricare nel gel

Frammento di DNA genomico con gene della β-globina

Determinazione della quantità in peso del frammento di DNA genomico contenente il gene della β-globina estraibile da 1 litro di batteri nei quali è stato clonato tale DNA (a livello di un vettore batterico ad alto numero di copie: 200)

1 litro di coltura batterica di E. coli ci sono 10¹² cellule

Se il DNA del gene della β-globina umana viene inserito in un vettore batterico che raggiunge 200 copie per cellula:

N° totale di molecole contenute in 1 litro = 10¹² x 200 = 2 10¹⁴

moli di DNA del gene della β-globina = 2 x 10¹⁴ / 6.02 10²³ = 3.3 10^-10 moli

= 3.3 10^-4 μmoli

μg di DNA gene della β-globina = 3.3 10^-4 μmoli x PM _{gene della β-globina}

= 3.3 10^-4 x 1.32 10⁶ Da = 4.2 10² = 420 μg

42 μg

420 μg

Reazione di digestione con 1 enzima di restrizione

Reazione di digestione con 1 enzima di restrizione

Digestione di 1 μg di DNA plasmidico (concentrazione di 1 μg/μl) utilizzando 4 U di enzima per μg di DNA da digerire (volume di reazione 20 μl).

20 μl

V_{DNA plasmidico} = Q / C = 1 μg / (1 μg/μl) = 1 μl

V_Tampone = V_Reazione /10X = 2 μl

V_Enzima = Q / C = 4 U / (10 U/μl) = 0.4 μl

V_H2O = 20 μl – 1 μl – 2 μl – 0.4 μl = 16.6 μl

Incubare in termostato a 37°C per 1-3 h

4 U di enzima per ogni μg di plasmide da digerire perché l'enzima di restrizione digerisce con più difficoltà il DNA superavvolto rispetto a quello lineare.

Reazione di digestione con 2 enzimi di restrizione

Reazione di digestione con 2 enzimi di restrizione

Digestione di 5 μg di DNA plasmidico (concentrazione 0.5 μg/μl) utilizzando 4U di entrambi gli enzimi per μg di DNA da digerire (volume di reazione 50 μl). Il tampone di reazione comune è il tampone 3, con l’aggiunta della Siero Albumina Bovina (BSA)

Totale reazione 50 μl

Incubare in termostato a 37°C per 1-3 h

Esercizio su efficienza di trasformazione

Esercizio

Se l'efficienza di trasformazione = 1.5 10⁸ colonie/µg quante colonie si otterranno utilizzando 1 µl della seguente ligazione?

10µl

1 µg = 1.5 10⁸ (teorico)

Preparazione dei frammenti di DNA genomico da clonare

Preparazione dei frammenti di DNA genomico da clonare

1. Digestione completa con un enzima di restrizione

Genoma umano = 2.8 10⁹ bp

a) Se l'enzima riconosce un sito di 6 basi (Es. EcoRI) taglierà mediamente ogni 4096 basi

Una libreria genomica umana deve contenere almeno n = 2.8 10⁹ / 4'096 = 6.8 10⁵ cloni

b) Se l'enzima riconosce un sito di 8 basi (Es. NotI) taglierà mediamente ogni 65’536 basi

Una libreria genomica umana deve contenere almeno n = 2.8 10⁹ / 65’536 = 4.7 10⁴ cloni

Elettroforesi di DNA genomico

Elettroforesi di DNA genomico

Domanda: quante molecole di DNA genomico sono presenti in un µg di DNA genomico estratto dal batterio E. coli (4,2 x 10⁶ bp)?

moli di DNA genomico = 1 x 10^-6 g / 4,2 x 10⁶ bp x 660 Da

= 3,6 x 10^-16

numero di molecole = moli di DNA genomico x Numero di Avogadro

= 3,6 x 10^-16 x 6,02 x 10²³

= 2,2 x 10⁸

Domanda: quante molecole di DNA genomico sono presenti in un 10 µg di DNA genomico estratto da cellule umane (3,3 x 10⁹ bp)?

moli di DNA genomico = 10 x 10^-6 g / 3,3 x 10⁹ bp x 660 Da

= 4,6 x 10^-18

numero di molecole = moli di DNA genomico x Numero di Avogadro

= 4,6 x 10^-18 x 6,02 x 10²³

= 2,8 x 10⁶

Complessità di una libreria genomica

Domanda: Quanti cloni devo produrre (e analizzare) per avere la certezza di isolare qualunque gene o frammento di DNA? Ovvero quale deve essere la complessità della mia libreria?

Per il DNA genomico umano (2.8 10⁹ bp), se i frammenti (di dimensione media di 20kb) fossero indipendenti il numero minimo n di cloni da produrre per coprire l'intero genoma sarebbe:

n = (Dimensione del genoma) / (Dimensione media dei frammenti) = (2.8 10⁹ bp) / (20 000 bp) = ~1.4 10⁵

n aumenta se si vogliono cloni sovrapposti

n x 2

n x 3 ecc.

Poiché nel clonaggio si esegue una sorta di campionamento (alcuni frammenti si clonano più volte, mentre altri raramente), il numero N di cloni ricombinanti che è necessario produrre per avere la probabilità P di includere nella libreria ogni particolare sequenza, è data dalla formula:

N = ln (1 - P) / ln (1 - 1/n)

Es. Se P = 95%, allora per una libreria genomica umana con inserti da 20 kb si dovrà produrre:

N = ln (1-0.95) / ln (1- 1/ 1.4 10⁵) = 4.2 10⁵ cloni

Es. Se P = 99%:

N = ln (1-0.99) / ln (1- 1/ 1.4 10⁵) = 6.5 10⁵ cloni

Esempio della collana

Collana = genoma di un organismo

100 perle = 100 frammenti genomici differenti

Molte copie identiche della collana vendono rotte e le perle inserite in un contenitore comune.

Quante perle N devo prelevare dal sacco per avere la probabilità P di ricostruire la collana?

Es. Se P = 95%,

N = ln (1 - 0.95) / ln (1 – 1/ 100) = 298 perle

Es. Se P = 99.99%:

N = ln (1-0.9999) / ln (1 – 1/ 100) = 916 perle