Produzione industriale di proteine e terapia genica
È effettuato per
- Produzione industriale di proteine
- Per le più semplici
- Vettori come E. coli o lieviti
- Per le più complesse
- Utilizzo di geni clonati in cellule animali
Per terapia genica
È la cura di un paziente introducendo un gene "sano" al posto di quello non funzionante.
Avviene tramite 2 metodi:
Infezione
È l'utilizzo di un virus per portare i geni nella cellula ospite.
Sfrutta:
- La capacità dei virus di integrare il proprio genoma nella cellula ospite.
- La capacità del virus di impossessarsi dell'apparato di biosintesi della cellula.
Trasfezione
Il procedimento:
È l'incorporazione diretta del DNA, utilizzando espedienti artificiali, in quanto la cellula non capta l'acido nucleico.
È un processo inefficiente.
- N° abbondante di cellule di partenza.
- Inizialmente anche la metà delle cellule può acquisire il gene nel nucleo.
- Espressione transitoria.
- DNA integrato correttamente in rapporto 1:1000.
- L'integrazione si realizza in siti casuali.
- Ampia variabilità nel livello di espressione.
- Necessità di utilizzare marcatori selezionabili.
Il più utilizzato:
Gene neo per la resistenza alla neomicina.
Le cellule contenenti il gene ricombinante (che comprende il gene neo) sopravvivono in presenza dell'antibiotico.
Metodi per il trasferimento genico in cellule animali
I metodi di seguito descritti avvengono tutti per infezione (si veda la mappa concettuale allegata).
1. Virus della scimmia SV40
Sostituzione di alcuni geni del virus con il DNA estraneo. Presenta limitazioni a causa del ristretto spettro di cellule che possono essere infettate e per le piccole dimensioni di DNA che può essere inserito.
2. Virus del vaiolo vaccino
Presenta un genoma molto grande, quindi possibilità di inserire grandi quantità di DNA.
3. Baculovirus
Durante l’infezione produce una proteina in grandi quantità. Un gene inserito a questo livello viene prodotto in alte quantità.
I virus appena descritti sono virus litici: entrano e si impossessano della cellula, replicandosi massivamente ed uscendo uccidendola. Non possono quindi essere utilizzati per introdurre geni in modo stabile.
Questo scopo viene raggiunto attraverso:
4. Retrovirus
Una volta nella cellula i loro genomi vengono convertiti a DNA. Il DNA virale si integra perfettamente con il DNA cromosomico, e si replica con esso.
Il provirus produce RNA virale, che può andare incontro a traduzione oppure costituire DNA per la formazione di nuovi virus.
Le particelle virali fuoriescono (gemmano) senza danneggiare in modo consistente la membrana cellulare; il genoma virale rimane quindi permanentemente all’interno della cellula.
I retrovirus sono quindi molto utili perché:
- Riescono a esprimere stabilmente un gene estraneo nelle cellule.
- Inseriscono il proprio genoma in modo casuale.
Gli svantaggi dei retrovirus sono:
- Alcuni infettano solo cellule in divisione (molte cellule dell’organismo non si dividono).
- Inseriscono il proprio genoma in modo casuale.
Si sono quindi cercate e sperimentate altre particelle virali:
5. Adenovirus
È il virus del raffreddore, particolarmente interessante perché:
- Sono virus innocui.
- Trasportano i geni nel nucleo, senza inserirli nei cromosomi, quindi vi è l'impossibilità di danneggiare altri geni importanti, anche se poi i geni funzionano solo temporaneamente.
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