Movimenti e strutture dei canali ionici voltaggio-dipendenti

Struttura dei canali ionici

Esiste una notevole somiglianza strutturale tra i vari canali ionici voltaggio-dipendenti. Ciascuna subunità dei canali K voltaggio-dipendenti, ovvero ciascuno dei quattro domini omologhi dei canali Na e Ca voltaggio-dipendenti è costituito da sei segmenti -elica transmenbrana. Di questi, il quarto segmento a partire dalla regione N-terminale, chiamato segmento S4, presenta molti aminoacidi basici (da 4 a 8) che lo rendono fortemente carico positivamente.

Ipotesi e mutagenesi

Sulla base di questi dati strutturali è stato proposto che il segmento S4 costituisce il sensore del potenziale nei canali voltaggio-dipendenti. Questa ipotesi è stata in seguito verificata con esperimenti di mutagenesi sito-specifica. A partire da un canale voltaggio-dipendente sono stati creati diversi canali mutanti, in ciascuno dei quali uno o più aminoacidi carichi presenti nel segmento S4 erano stati sostituiti con residui neutri. Sulla base dell’ipotesi proposta, alla rimozione dei residui carichi doveva corrispondere una riduzione della sensibilità del canale al potenziale, cioè una riduzione del parametro zg nella relazioni PO-voltaggio. Come atteso, si vide che canali mutanti espressi negli oociti di Xenopus mostravano una voltaggio dipendenza (cioè un valore di zg) che correlava inversamente con il numero di residui carichi rimossi. Ulteriori studi sono stati condotti per ottenere informazioni sul tipo di movimento che il segmento S4 compie durante i cambiamenti di voltaggio. In un primo set di esperimenti si sono ottenute informazioni sull’accessibilità ai versanti intra e extracellulari dei vari residui del segmento S4.

Esperimenti di accessibilità

A tal fine ciascun residuo, dopo essere stato sostituito con l’aminoacido cisteina, veniva saggiato per la capacità di essere modificato da parte del reagente metantiosulfonato, aggiunto alle soluzioni intra e extracellulari. Questi esperimenti hanno mostrato, con molta sorpresa, che solo 10 residui sono inaccessibili a questo reagente. Poiché 10 residui in un’-elica corrispondono a una lunghezza di circa 13 Å - meno della metà dello spessore di una membrana lipidica - questo risultato ha fatto ipotizzare che il segmento S4 è circondato, per la maggior parte della sua lunghezza, da vestiboli intra e extracellulari in cui le soluzioni acquose possono facilmente penetrare. I due vestiboli sarebbero separati da una regione centrale lunga circa 13 Å in cui le soluzioni ioniche accedono con difficoltà. Poiché questa regione presenta una elevata resistenza al passaggio degli ioni, molto probabilmente è lì che la maggior parte della differenza di potenziale applicata ai lati della membrana andrà a cadere.

Movimento del segmento S4

Stessi esperimenti di accessibilità sono stati condotti per canali tenuti nella conformazione chiusa e nella conformazione aperta. Dal loro confronto si osserva che l’apertura del canale porta ben 9 nuovi residui del segmento S4, di cui 3 residui carichi positivamente, in una posizione accessibile al metantiosulfonato dal lato extracellulare. Altri 9 residui, di cui 3 carichi positivamente, che nello stato chiuso erano accessibili dal lato intracellulare, diventano invece inaccessibili. Tale movimento, esponendo ben tre cariche positive al versante extracellulare e rimuovendo altre tre cariche positive dal versante intracellulare, si traduce in un movimento netto di 3 cariche positive lungo la zona a alta resistenza presente tra i due vestiboli, in cui, come già detto, cade probabilmente la maggior parte della differenza di potenziale applicata. Ciò significa che a questo movimento dovrebbe corrispondere una carica di gating pari a 3 per ogni segmento S4del canale, ovvero una carica di gating totale pari a 12, un valore molto vicino a quello sperimentalmente trovato.

Rotazione del segmento S4

Ulteriori esperimenti hanno poi mostrato che durante il movimento traslatorio appena descritto, il segmento S4 affronta anche un movimento rotatorio. Questi esperimenti, condotti sui canali K Shaker, consistevano nel misurare la distanza esistente tra residui aminoacidici omologhi sui segmenti S4 appartenenti allo stesso canale, usando una tecnica chiamata trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza (FRET). I dati ottenuti per diversi residui aminoacidici suggeriscono che durante i cambiamenti del potenziale di membrana i segmenti S4 subiscono una rotazione in senso orario pari a 180°, se visto dal lato extracellulare. Il movimento proposto per il segmento S4 sarebbe quindi sia traslatorio che rotatorio, simile a quello compiuto da una vite.