Analisi della cinetica e del gating nei canali ionici voltaggio-dipendenti

Cambiamenti della Po nei canali

Nei precedenti paragrafi abbiamo considerato i cambiamenti della Po che si osservano quando un canale ionico voltaggio-dipendente è tenuto per lunghi periodi a diversi potenziali di membrana. In altre parole abbiamo analizzato la voltaggio-dipendenza di stato-stazionario.

Cinetica di rilassamento e patch-clamp

Un altro aspetto importante è la cinetica di rilassamento dei canali voltaggio-dipendenti, ovvero la velocità con cui la Po cambia in seguito al cambiamento del potenziale. La cinetica di rilassamento può essere studiata applicando ripetutamente uno stesso stimolo depolarizzante a un canale voltaggio-dipendente. In risposta a ogni stimolo depolarizzante il canale passa da una situazione di totale chiusura, a una avente un Po significativamente diversa da zero. A causa della natura stocastica del gating, il cambiamento di attività sarà leggermente diverso ogni volta che lo stimolo viene ripetuto. Una misura della velocità media con cui questo rilassamento avviene può essere ottenuta sommando tutte le tracce di singolo canale ottenute. Si produce in questo modo un ‘ensemble averagè, ovvero una traccia di corrente i cui cambiamenti temporali rispecchiano la velocità media con cui il singolo canale si apre in seguito allo stimolo depolarizzante. Lo studio della cinetica di rilassamento di un canale ionico può essere più semplicemente condotto utilizzando una variante della tecnica del patch-clamp chiamata configurazione whole-cell. Come già descritto, questa configurazione permette di misurare le correnti macroscopiche che passano attraverso tutti i canali presenti nella membrana plasmatica. Applicando uno stimolo depolarizzante in questa configurazione si ottengono tracce di corrente simili a quelle ottenute dall’ensemble average fatto su un singolo canale (confronta con le tracce in alto). L’unica differenza è che mentre l’ensemble average viene ottenuto sommando le risposte di un solo canale a ripetute stimolazioni, la traccia in configurazione whole-cell rappresenta l’attivazione di tutti i canali presenti nella cellula durante un unico stimolo depolarizzante.

Schema cinetico e modello di gating

In altre parole la velocità con cui i canali si aprono è piccola all’inizio dello step depolarizzante per poi aumentare e nuovamente decrescere. In questo schema sono presenti ben quattro stati chiusi connessi in sequenza, dall’ultimo dei quali il canale può entrare in un unico stato aperto. Si noti anche che le costanti di transizione tra uno stato e l’altro sono tutte esprimibili come multipli di due costanti fondamentali, α e β. Questo particolare schema cinetico deriva da un modello di gating ben in accordo con la struttura trovata per questi canali. Come abbiamo visto, i canali K voltaggio-dipendenti sono formati da quattro subunità proteiche che di assemblano a formare un canale funzionale. Nel modello di gating proposto ogni subunità può esistere in due possibili conformazioni, una chiamata non-permissiva, N, e l’altra permissiva, P. Le costanti α e βrappresentano le costanti di velocità per la transizione N->P ed P->N, rispettivamente.

Transizioni tra stati e costanti

Affinché un canale sia funzionalmente aperto tutte e quattro le subunità devono trovarsi nella conformazione permissiva. Negli altri casi, in cui tutte le subunità sono nella conformazione non-permissiva oppure in cui solo alcune delle subunità sono nella conformazione permissiva, il canale è funzionalmente chiuso. Da questa situazione il canale può passare allo stato C1, quando una delle quattro subunità passa allo stato conformazionale P. Poiché le subunità che possono affrontare questa transizione sono quattro, la costante di transizione che porta da C0 a C1 avrà un valore pari al quadruplo della costante fondamentale α. Dallo stato C1 il canale passa allo stato chiuso C2 se una delle tre restanti subunità nella conformazione N passa alla conformazione P. Poiché in questo caso sono tre le subunità che possono affrontare questa transizione, la costante di transizione che porta da C1 a C2 varrà 3 α. Considerazioni analoghe valgono per gli stati C3, ed O, quest’ultimo, come detto, caratterizzato dall’avere tutte e quattro le subunità nella conformazione P. Un ragionamento simile, ma inverso, a quello appena fatto può spiegare i valori delle costanti di transizione che, nello schema, si dirigono verso sinistra.