Schemi integrati con slide di biologia molecolare

Scoperta DNA pol

Kornberg, l’enzima è fatto reagire in presenza di molecole di DNA che contengono diverse quantità di coppie di basi. In ciascun caso il prodotto sintetizzato aveva lo stesso rapporto di basi del DNA stampo. Sthal e Meselson condussero un esperimento in cui separarono le molecole neosintetizzate di DNA e dimostrarono che due filamenti si separano definitivamente durante la replicazione.

Dogma centrale

Il DNA è lo stampo per la sua autoreplicazione. La sintesi di RNA mediante trascrizione è diretta da uno stampo di DNA. La sintesi di proteine, quindi la traduzione, è diretta da uno stampo di RNA. La sequenza dell’RNA non è mai determinata da uno stampo proteico, né si può pensare che il DNA venga prodotto da uno stampo di RNA.

Legami chimici

Un legame chimico rappresenta una forza d’attrazione che tiene uniti gli atomi. Aggregati atomici di dimensioni definite vengono chiamati molecole. I legami forti non vengono quasi mai distrutti alle temperature fisiologiche, i legami deboli vengono rotti facilmente e diventano stabili solo quando sono disposti in gruppi ordinati. Il numero massimo di legami covalenti che un atomo può formare viene detto valenza. I legami covalenti si formano quando gli elettroni vengono condivisi tra gli atomi di una molecola. L’angolo che si forma tra due legami convergenti su un singolo atomo è chiamato angolo di legame. È approssimativamente sempre lo stesso. I legami differiscono anche per la libertà di rotazione.

I legami più deboli sono quelli di van der Waals. Quasi tutte le molecole formano un numero di legami deboli molto vicino al numero degli atomi che le compongono. Tutte le molecole sono in grado di formare legami van der Waals, mentre per quelli idrogeno o ionici è necessaria una carica. La separazione delle cariche elettriche può essere permanente o temporanea, a seconda degli atomi coinvolti. Se il centro della carica positiva non si sovrappone a quello della carica negativa, ci troviamo di fronte a un dipolo elettrico. Molecole come l’acqua che hanno le caratteristiche del dipolo vengono chiamate molecole polari.

Van der Waals

Legami determinati da forze di attrazione non specifiche, si creano quando due atomi si avvicinano l’uno all’altro. Non si ha una separazione di carica permanente ma una fluttuazione indotta dalla vicinanza. Possono crearsi in tutti i tipi di molecole. Può esistere una repulsione dovuta alla sovrapposizione degli elettroni sul guscio più esterno. I legami si bilanciano a una distanza definita raggio di vdW. Alle temperature fisiologiche rappresentano un’effettiva forza di legame solo quando un numero elevato di atomi interagisce con altrettanti atomi di un’altra molecola. Queste forze sono dovute al fatto che la distribuzione di carica elettronica varia. Perché possa avvenire la conformazione molecolare deve garantire la distanza adeguata e interazioni steriche ben precise. Sono interazioni specifiche ma reversibili.

Legami idrogeno

Un legame idrogeno si forma tra un atomo di idrogeno donatore (carica +) e un accettore di idrogeno (carica -). È un caso particolare di interazione tra dipoli. I legami più forti sono quelli con una maggiore differenza di carica tra atomi donatori e accettori. Sono più deboli dei covalenti. La distanza tra gli atomi è inferiore al raggio di vdW ma superiore a quella dei covalenti. I legami idrogeno sono direzionali e richiedono l’esistenza di molecole con gruppi accettori/donatori. Hanno un massimo energetico quando si ha un allineamento. Sono importanti per interazioni specifiche ma reversibili e sono rilevanti se numerosi. Conferiscono specificità.

Legami ionici

Molte molecole organiche possiedono gruppi ionici che contengono una o più cariche nette positive o negative. Queste cariche sono neutralizzate da gruppi dotati di una carica opposta e che si trovano nelle vicinanze.

I legami deboli si creano solo quando le superfici interagenti possono avvicinarsi l’una all’altra. Ciò è possibile quando possiedono una struttura complementare. Per esempio alcune molecole polari contengono adeguati atomi accettori.

La struttura specifica di una soluzione è influenzata dalle molecole presenti perché le molecole differiscono per il tipo di legami secondari che possono instaurare.

1 |

Interazioni idrofobiche

Le molecole idrofobiche tendono a raggrupparsi escludendo l’acqua e formando strutture sferiche. I legami sono importanti sia per stabilizzare la struttura delle proteine sia per la formazione di complessi tra proteine e altre molecole. Le interazioni guidano la formazione della doppia elica, con le basi aromatiche all’interno e lo scheletro zucchero fosfato polare esposto all’acqua.

I legami deboli sono il mezzo necessario affinché gli enzimi si leghino al loro substrato. Permettono un corretto posizionamento delle proteine sulle molecole di DNA e RNA. Le interazioni tra proteine e DNA e proteine/proteine sono alla base dei meccanismi con i quali le cellule recepiscono i segnali e rispondono ad essi. (Ricorda che le proteine possono interagire con il DNA in diversi modi: mediante riconoscimento di sequenze di basi o di conformazioni della doppia elica.)

Ogni specifica molecola ha una propria energia libera, la disparità è data dal fatto che i legami covalenti hanno diverse energie di legame.

Tutti i processi degradativi hanno due scopi:

• La produzione di precursori per la sintesi di altre molecole organiche.
• La conservazione di una parte dell’energia libera della molecola degradata in una forma utilizzabile per le attività cellulari.

Alcuni passaggi sono accoppiati alla sintesi di molecole ad alta energia. L’ATP è la molecola ad alta energia più importante. I legami la cui idrolisi porta a elevati valori negativi sono detti legami ad alta energia. Molti processi biosintetici sono il risultato di reazioni accoppiate: la prima fornisce energia facendo in modo che la seconda avvenga in modo spontaneo. Sono sempre reazioni di trasferimento di gruppo in cui le molecole si scambiano gruppi funzionali. Tutte le reazioni portano al rilascio di P∽P che viene scisso. La sintesi dell’ATP ha un ruolo fondamentale nell’accumulo controllato di energia nelle molecole che fungono da donatori di energia. Il ruolo sfrutta la presenza nella molecola di due legami ad alta energia la cui rottura rilascia gruppi specifici.

Entrambi i tipi di acidi nucleici vengono sintetizzati a partire da monomeri mono-nucleotidici, detti nucleosidi fosfati. L’energia libera per la sintesi degli acidi nucleici deriva dall’idrolisi del gruppo pirofosfato ad alta energia.

Struttura del DNA

Il DNA è formato da due catene polinucleotidiche avvolte l’una sull’altra nella forma a doppia elica. Esso codifica per l’informazione ereditaria e per l’informazione per il mantenimento delle funzioni cellulari. Il costituente fondamentale è il nucleotide e consiste di un fosfato legato ad uno zucchero (2’deossiribosio) a cui è attaccata una base azotata. Da un punto di vista chimico le basi azotate sono dei composti eterociclici aromatici, ovvero composti ad anello che presentano uno o più atomi diversi dal carbonio.

Lo zucchero unito alla sola base forma il nucleoside. Il nucleotide è formato quindi mediante la formazione di un legame glicosidico fra la base e lo zucchero e un legame fosfodiesterico tra base e l’acido fosforico. I nucleotidi possono portare il gruppo fosfato in posizione 5’ o 3’. I nucleotidi sono legati tramite legami fosfodiesterici in cui il fosforo tra due è unito a uno zucchero esterificato mediante l’ossidrile 3’ e un secondo con il 5’. Il legame crea un’impalcatura ripetitiva zucchero-fosfato che è caratteristica costante del DNA. I legami fosfodiesterici conferiscono una polarità alla catena, determinata dall’asimmetria dei nucleotidi e dal modo in cui sono legati. Le basi del DNA sono anelli eterociclici planari e possono essere purine o pirimidine.

Watson/Crick

Individuarono la configurazione più favorevole e stereochimicamente compatibile con i dati di diffrazione ai raggi X precedenti. Nella doppia elica, le due catene di DNA sono tenute unite da legami idrogeno tra coppie di basi su filamenti opposti. Nella foto a raggi X le linee di diffrazione che si uniscono al centro sono indice di una struttura elicoidale. Le regioni scure mostrano che le basi sono impilate regolarmente a una distanza di 3.4 Å e perpendicolari all’asse dell’elica.

2 |

I due filamenti avvolti tra loro suggerivano che un filamento servisse da superficie specifica stampo sulla quale si formava l’altro.

La regola di Chargaff

Il rapporto dei quattro nucleotidi varia da specie a specie. Il rapporto relativo delle quattro basi non è casuale, il numero di residui di Adenina è uguale a quello della Timina, così come il numero di Guanina è uguale alla Citosina. Il rapporto purine-pirimidine era sempre uguale a 1.

La doppia elica è composta da due catene polinucleotidiche che sono allineate secondo un orientamento opposto. Le due catene interagiscono grazie agli appaiamenti tra le basi. La precisione nell’applicazione della regola di Watson e Crick è imposta sia dalla forma sterica delle basi che dalla possibilità di formare legami idrogeno tra A:T e G:C. Una coppia G:C possiede 3 legami. Un’importante caratteristica della doppia elica è che le due coppie di basi hanno esattamente lo stesso ingombro trasversale. (Distanza tra C1’ costante per entrambi gli appaiamenti).

Le coppie di basi possono impilarsi l’una sull’altra rimanendo all’interno dell’impalcatura degli zuccheri-fosfati.

I legami idrogeno tra le basi sono una caratteristica fondamentale della doppia elica, contribuendo alla stabilità termodinamica dell’elica e alla specificità delle coppie di basi. Ci sono quindi fattori che stabilizzano la doppia elica di DNA:

• Legami idrogeno tra le basi.
• Interazioni di impilamento tra le basi: le basi sono insolubili e planari e tendono a impilarsi perpendicolarmente all’asse longitudinale della doppia elica. Le interazioni fra le nuvole elettroniche contribuiscono alla stabilità, a causa dei dipoli indotti transienti definiti attrazione di van der Waals.
• Interazioni idrofobiche tra le basi: le superfici idrofobiche sono nascoste all’interno della doppia elica riducendo al minimo l’esposizione all’acqua e quindi abbassando l’energia libera della doppia elica.

Ci sono fattori che destabilizzano la struttura come la possibile repulsione dovuta alle cariche negative dei gruppi fosfato. Le cariche negative sono neutralizzate da cariche positive o attraverso interazioni elettrostatiche con residui di proteine basiche. Il DNA è quindi una struttura dotata di elevata stabilità.

I livelli energetici della doppia elica favoriscono l’appaiamento di ciascuna base di un filamento con la base complementare dell’altro. A volte però le basi possono protrudere dalla doppia elica con il base flipping. Ci sono allora enzimi che metilano le basi o le rimuovono direttamente.

L’angolo formato dalla protrusione dei due zuccheri dalle coppie di basi è di circa 120° e 240°, come risultato si forma un solco maggiore e un solco minore. I bordi di ciascuna coppia di basi si affacciano nei solchi creando un sistema di donatori e accettori di legami idrogeno. (A accettore di legame, D donatore, M gruppo metilico e H idrogeno non polare). Il solco minore per le sue dimensioni ha ridotte capacità di accogliere gruppi laterali di aa. Il solco maggiore è di 22Å mentre il minore di 12Å.

Forma B

Forma del DNA più comune in vivo. Si trova in una soluzione ad alto grado di umidità e contiene 10 coppie di basi per giro d’elica. Ha un ampio solco maggiore e un minore più stretto. Presenta due filamenti che si avvolgono intorno ad un asse comune in senso destrorso. Le basi occupano la parte centrale e lo scheletro zucchero-P si trova all’esterno limitando l’effetto repulsivo dei gruppi fosfato. La distanza tra le coppie di basi è di 3.4Å e la rotazione dell’elica per ogni coppia di basi è 36°. L’inclinazione delle basi è di 6°.

Forma A

La forma A si osserva in soluzione a basso contenuto d’acqua, ha 11 coppie di basi per giro d’elica e il solco maggiore è più stretto rispetto alla forma B. La forma A si trova maggiormente in corrispondenza di complessi DNA-proteine. Le basi sono inclinate rispetto all’asse della doppia elica di circa 20° (angolo di TILT). In questa forma è presente un foro centrale. Alcuni esempi sono i complessi DNA proteine e gli ibridi DNA:RNA e dsRNA.

Forma Z

3 |

Il DNA Z è un’elica sinistrorsa con un’impalcatura con andamento a zigzag. L’analisi di diffrazione ai raggi X ha mostrato un corto DNA ricco in CG in condizioni di elevata salinità. Non è osservato in vivo, è levogiro e presenta 12 coppie di basi per giro d’elica. Il diametro è di 18Å e l’angolo di tilt è 9°. Caratteristico dei tratti purina-pirimidina alternati. Si trova in strutture transienti (per scaricare superavvolgimento negativo). Vi sono proteine che legano DNA Z con grande specificità e sono importanti per la virulenza di alcuni poxvirus (Virus vaccino e del vaiolo). Si ha la presenza di anticorpi anti DNA-Z in malattie autoimmuni (lupus eritematoso).

Nella configurazione destrorsa il legame glicosidico è sempre nella forma anti, mentre nella forma sinistrorsa vi sono delle fondamentali ripetizioni di dinucleotidi purine-pirimidine.

I filamenti complementari possono separarsi quando una soluzione di DNA viene scaldata oltre la temperatura fisiologica (100°) o a elevato pH. Questo processo viene definito denaturazione ed è reversibile. La possibilità di rinaturare permette la formazione di molecole ibride artificiali semplicemente abbassando la temperatura di DNA denaturato. Allo stesso modo si possono formare ibridi mescolando DNA e RNA. La capacità viene detta reazione di ibridazione.

Alcune coppie di basi adiacenti (per es. A-T/A-T), non essendo perfettamente parallele, introducono piccoli piegamenti della molecola duplex; se tali perturbazioni sono distribuite in maniera casuale lungo la molecola di DNA, risultano in una struttura un po’ irregolare ma sostanzialmente dritta. Se la sequenza nucleotidica è tale per cui i piccoli angoli tra le coppie di basi adiacenti si ripetono regolarmente a ogni giro di elica (cioè ogni 10 pb), gli angoli si sommano tra loro e risultano in una curvatura intrinseca della molecola di DNA.

Topologia

Il DNA è una molecola flessibile; i parametri strutturali che lo caratterizzano sono in funzione sia delle condizioni ioniche dell’ambiente sia della natura delle proteine che interagiscono con esso. Quando le estremità sono legate il numero di volte che un filamento gira attorno all’altro non varia e si tratta di un cccDNA (DNA circolare covalentemente chiuso).

Il numero di volte che un filamento deve essere fatto passare attraverso l’altro affinché le due catene possano separarsi l’una dall’altra viene indicato come linking number.

Il bromuro di etidio è un intercalante che modifica la topologia del DNA. È una molecola idrofobica  il planare che si intercala tra le coppie di basi della doppia elica cambiandone in vari modi la topologia: la doppia elica si allunga, il twist diminuisce e diminuisce il superavvolgimento.

Il linking number è la somma di due componenti: il twist e il writhe. Il twist è il numero di volte che un filamento gira attorno all’altro. Essendo il cccDNA non planare, presenta tensioni torsionali che impongono all’asse di incrociarsi. L’incrocio viene definito writhe. Può presentarsi in due forme:

• Plectonemico in cui l’asse longitudinale è avvolto su se stesso.
• Toroide in cui l’asse è avvolto come attorno a un cilindro.

Il Lk = Tw + Wr

Il superavvolgimento negativo si ha quando i superavvolgimenti sono nella direzione opposta dell’avvolgimento della doppia elica di DNA. Se srotolato, causa una parziale separazione degli strand dell’elica. Il positivo invece è nella stessa direzione dell’elica e se srotolato determina che l’elica si superavvolge. Il superavvolgimento è una forma di immagazzinamento di energia libera (-9kJ).

L’energia libera contenuta in una molecola superavvolta può indurre transizioni strutturali. Una molecola cccDNA può scaricare la tensione torsionale in varie maniere: il duplex si può denaturare localmente (preferenzialmente in regioni ricche A:T); se sono presenti sequenze ripetute e invertite, si può avere la formazione di strutture cruciformi; se sono presenti tratti con alternanza purina/pirimidina il DNA può assumere la struttura Z.

Topoisomerasi

Enzimi in grado di introdurre una rottura del singolo o doppio filamento del DNA in modo temporaneo per variare il linking number. Possono essere divise in due classi principali:

4 |

Le topoisomerasi di tipo II permettono di variare il numero di legame topologico di due unità per volta. Determinano una rottura dei due filamenti attraverso la quale fanno passare un tratto di elica integro, prima che il taglio sia risaldato.

Le topoisomerasi di tipo I permettono di cambiare il numero di legame un’unità per volta. Esse producono rotture temporanee a singolo filamento, consentendo in questo modo al filamento integro di passare attraverso la rottura dell’altro. Non richiedono ATP, a differenza del tipo II.

Il taglio della molecola di DNA avviene quando un residuo di tirosina attacca un legame fosfodiesterico dell’impalcatura della molecola di DNA bersaglio. Questo attacco causa una rottura e la topoisomerasi rimane attaccata tramite legame covalente.

Il DNA può essere risaldato semplicemente invertendo la reazione: il gruppo OH esistente all’estremità de