Schema su Dna e tecniche di base

Transfezione e linee cellulari

Transfezione: mediata da peptidi; iniezione; mediata da virus; mediata da liposomi; elettroporazione; metodi chimici.

Linee cellulari secondarie: mediata da liposomi: non si tratta di normali liposomi (vescicole a doppio strato lipidico che racchiudono una sostanza idrofila) ma di lipidi che formano vescicole lungo il DNA favorendone l'ingresso attraverso la membrana.

Metodi di transfezione: tendono ad aumentare la permeabilità della membrana al DNA superando l'ostacolo dell'ingresso del DNA costituito dalla matrice extracellulare.

Linee cellulari primarie: le cellule ottenute da tessuto non si dividono o lo fanno per poche volte prima di andare incontro a senescenza (incapacità di proliferare) e morire.

Cellule ottenute da tessuto riescono a dare numerose generazioni prima di morire.

I vantaggi sono: facile esecuzione, riproducibile, i liposomi evitano la degradazione del DNA entrato.

Trasformazione e cultura di cellule animali

Esistono diverse tecniche di trasformazione: trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico; elettroporazione; Gene gun; infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno (metodo usato per eucarioti e batteri); microiniezione (cellule mammifero).

Cultura di cellule animali:

• Si preleva frammento di tessuto.
• Digestione con proteasi per degradare matrice extracellulare e separare le cellule.
• Trasferimento con terreno e fattori di crescita per stimolare la proliferazione.

La trasformazione ha una efficienza minore del 100%, quindi è necessario distinguere le cellule trasformate da quelle non trasformate -> si utilizzano marcatori di selezione.

Affinché sia mantenuto nell'ospite e trasmesso alle generazioni successive deve essere integrato in una unità di replicazione funzionante -> si tratta del vettore di clonaggio.

Efficienza di trasformazione: quantità di trasformati/quantità DNA.

Microiniezione di DNA

Microiniezione di DNA: DNA iniettato nel nucleo delle cellule in coltura applicabile su cellule di grossa taglia (bassa probabilità di integrazione).

Consiste nel trasferimento di DNA esogeno all'interno di una cellula ospite.

Il DNA è una molecola che attraversa difficilmente le membrane -> si utilizzano metodi di trasformazione in E. coli ospite standard di clonaggio date la elevata efficienza raggiungibile.

Linee cellulari trasformate: in seguito a cambiamenti genetici le cellule perdono il controllo sulla divisione cellulare e crescono indefinitamente (linee immortalizzate).

Analisi del DNA

Il taglio e la riunione del DNA avviene con enzimi di restrizione e DNA ligasi.

Concetto di trasformazione e metodi di trasformazione.

Come introdurre DNA in cellula ospite.

Analisi ad alta risoluzione del DNA.

Elettroforesi su gel.