Scambio del materiale genetico tra batteri

Scambio del materiale genetico tra batteri

I batteri sono in grado di scambiare il materiale genetico utilizzando tre diversi meccanismi che sono: coniugazione, trasformazione, trasduzione. Ciascuno di questi meccanismi prevede un trasferimento di DNA da una cellula batterica detta donatrice a un'altra cellula batterica detta ricevente. Il trasferimento può avvenire con i tre meccanismi con modalità diverse. Solitamente, viene trasferito solo un frammento di cromosoma che potrà poi integrarsi nel cromosoma della cellula ricevente per ricombinazione attraverso un doppio crossing-over.

La coniugazione

È un processo con il quale i batteri trasferiscono del materiale genetico attraverso un contatto diretto. Il trasferimento è unidirezionale da una cellula donatrice verso una cellula ricevente. Questo processo di scambio di DNA tra i batteri è stato scoperto, per la prima volta, nel 1946 da Lederberg e Tatum con un esperimento. Abbiamo visto che è possibile farli crescere sia su terreni solidi che su terreni liquidi. Un terreno tipico di coltura per la crescita dei batteri contiene acqua, una fonte di carbonio organico (di solito uno zucchero) e alcuni sali inorganici. I batteri selvatici o prototrofi possono utilizzare questi semplici terreni (noti come terreni minimi) per sintetizzare tutti i metaboliti necessari alla loro crescita e riproduzione, quali amminoacidi, basi puriniche e pirimidiniche, le vitamine. Questo perché nel loro genoma sono presenti tutte le informazioni necessarie per la sintesi di questi composti essenziali. Vi sono alcuni ceppi batterici detti auxotrofi che, a causa di mutazioni nel loro DNA, non hanno la capacità di sintetizzare una o più di queste sostanze fondamentali che dovranno quindi essere aggiunte nel terreno di coltura. Ad esempio, un ceppo batterico auxotrofo per metionina (indicato con met-) è un batterio in cui il gene codificante per un enzima richiesto per la biosintesi di questo amminoacido è mutato, non funzionante, per cui questo ceppo per potersi riprodurre avrà bisogno che, nel terreno di crescita, sia presente la metionina in quanto non in grado di sintetizzarla da solo.

Torniamo all’esperimento di Lederberg e Tatum con il quale hanno dimostrato che i batteri possono scambiare materiale genetico. I due ricercatori lavoravano con due ceppi batterici di E. Coli che differivano tra loro per le richieste nutrizionali. Il ceppo A era auxotrofo per l’amminoacido metionina e per la vitamina biotina, cioè poteva crescere solo se il terreno minimo veniva addizionato con queste due sostanze. Non necessitava, invece, degli amminoacidi treonina e leucina né della vitamina tiamina. Il genotipo di questo ceppo è quindi indicato con il segno “-” per quei marcatori per cui il ceppo è auxotrofo (metionina e biotina) e con il segno “+” per quei marcatori per cui il ceppo è invece selvatico. L’altro ceppo di E. Coli, indicato come ceppo B, è invece auxotrofo per treonina, leucina e tiamina, mentre di genotipo selvatico per metionina e biotina. Per cui, questo ceppo poteva crescere su terreno minimo solo se al terreno venivano aggiunti treonina, leucina e tiamina. Come si vede in figura, se sia il ceppo A che il ceppo B vengono messi separatamente a crescere su un terreno minimo, non si ottiene nessuna colonia. Se però il ceppo A e il ceppo B venivano prima mescolati tra di loro e poi fatti crescere su un terreno minimo, allora compariva qualche colonia ad indicare che alcuni batteri erano diventati prototrofi, cioè di genotipo selvatico per tutti e cinque i geni e quindi si erano replicati su un terreno minimo. I due ricercatori conclusero che, nel corso del rimescolamento, si era verificato qualche tipo di trasferimento e ricombinazione di materiale genetico tra i due ceppi batterici, anche se ignoravano quale fosse questo meccanismo.

Al fine di studiare più a fondo questo meccanismo di ricombinazione genetica, Bernard Davis utilizzò un tubo a forma di U (come in figura) in cui i due bracci erano separati da un filtro. I due ceppi auxotrofi A e B dell’esperimento precedente vennero messi separatamente in ognuno dei due bracci. Il filtro di separazione aveva dei pori molti piccoli che consentivano il passaggio del terreno da un braccio all’altro ma non dei batteri. Dopo un lungo periodo di incubazione, i ceppi A e B vennero prelevati dai due bracci del tubo e separatamente piastrati su terreno minimo. Il tutto per vedere se, durante l’incubazione con il passaggio del solo terreno da una parte all’altra, si fossero generati dei batteri prototrofi. Tuttavia, come si può vedere in figura, non si ottenere alcune crescita batterica. Questo indicava che, se i ceppi sono tenuti separati, non possono scambiare materiale genetico e quindi dare origine a batteri ricombinanti, prototrofi, capaci di crescere su terreno minimo. In altre parole, affinché tale scambio possa avvenire è necessario che i batteri entrino in contatto fisico tra di loro cioè è necessario che avvenga una coniugazione.

Alcuni anni più tardi, un altro ricercatore Williams Heils scoprì che, nella coniugazione, una cellula batterica si comporta da donatore di materiale genetico e l’altra da ricevente. Quindi lo scambio di DNA non è reciproco ma unidirezionale. Quali caratteristiche deve avere una cellula per comportarsi da donatore o da ricevente?

Parlando dei plasmidi avevamo accennato i cosiddetti plasmidi coniugativi cioè quelli che sono in grado di trasferirsi da una cellula batterica ad un’altra. Infatti, la capacità di un ceppo batterico di comportarsi da donatore nella coniugazione e quindi di trasferire materiale genetico ad una cellula ricevente, dipende dalla presenza di uno di questi plasmidi detto fattore F (detto anche fattore di fertilità). Questo è un plasmide capace di replicarsi autonomamente rispetto al cromosoma batterico a partire da una propria origine di replicazione detta OriV. Possiede, inoltre, i geni che sono coinvolti nel processo di trasferimento tra cui quelli che controllano la sintesi dei pili sessuali F che sono delle strutture filiformi presenti sulla superficie della cellula donatrice e che consentono di stabilire il contatto con la cellula ricevente. Inoltre, è presente una regione detta origine di trasferimento (OriT) e delle sequenze di inserzione IS. I ceppi batterici che possiedono il fattore F e si comportano quindi da donatori sono indicati come F+ mentre quelli che non lo possiedono sono indicati come F- e quindi si comportano come riceventi.

Quando una cellula donatrice stabilisce un contatto, tramite pili sessuali, con una cellula F- si genera un ponte citoplasmatico tra le due cellule che le connette fisicamente e attraverso il quale avviene il trasferimento del materiale genetico. Il fattore F si replica con il meccanismo del cerchio rotante e una sua copia passa dalla cellula donatrice alla cellula ricevente. Nella replicazione a cerchio rotante avviene un taglio a singolo filamento che, sul fattore F, si verifica a livello del sito OriT. Il taglio genera due estremità libere, una al 3’ OH e una al 5’ fosfato. L’estremità 5’ a singolo filamento si allontana ed entra, attraverso il ponte citoplasmatico, nella cellula ricevente dove viene convertito in doppia elica di DNA producendo quindi una copia del plasmide F circolare. Contemporaneamente nella cellula donatrice, all’estremità 3’ OH, ha inizio la sintesi del DNA utilizzando come stampo il filamento rimasto intatto. Al termine della coniugazione, quando le due cellule si separano, una copia del fattore F rimane nel donatore e una copia si trova nella cellula ricevente. Questa si è quindi trasformata da cellula F- a cellula F+.

Il fattore F, in realtà, è un episoma cioè un plasmide che può integrarsi all’interno del cromosoma batterico. I ceppi batterici che possiedono il fattore F integrato nel proprio cromosoma sono detti ceppi Hfr (high frequency of recombination). Questo nome in quanto questi ceppi, se mescolati con cellule F-, danno origine ad un numero elevato di batteri ricombinanti.

Il fattore F si può integrare, nel cromosoma batterico, per un evento di ricombinazione (simile al crossing-over) che ha luogo in corrispondenza di sequenze di DNA omologhe presenti sia sul fattore F che sul cromosoma batterico. Queste sequenze di omologia sono le sequenze d’inserzione IS cioè gli elementi trasponibili che localizzano sia sul fattore F che in più copie sul cromosoma batterico. In figura è schematizzato questo evento di crossing-over che avviene in corrispondenza delle sequenze IS (rappresentate dalle aree tratteggiate). Dal momento che esistono più copie degli elementi IS sul cromosoma batterico, ciascuno di essi può rappresentare un punto d’inserzione per il fattore F. Ciò significa che, su cromosomi diversi, il fattore F si può integrare in punti diversi.

Nel caso della coniugazione tra cellule F+ e cellule F-, a trasferirsi da una cellula all’altra è unicamente una copia del plasmide F ma nessun gene presente sul cromosoma batterico viene trasferito. Affinché due cellule batteriche possano, con la coniugazione, trasferire geni cromosomici è necessario che la cellula donatrice sia una cellula Hfr cioè una cellula in cui il fattore F è integrato nel cromosoma batterico. Le cellule Hfr, come le cellule F+, possono coniugare solo con le cellule F- ma non tra loro.

I ceppi Hfr presentano due caratteristiche importanti che li distinguono dai ceppi F+. La prima caratteristica è che se vengono incrociati, mediante coniugazione, con ceppi F- producono dei ricombinanti con una frequenza molto elevata. La seconda caratteristica è che negli incroci tra un ceppo Hfr e un ceppo F- non avviene mai la conversione dei ceppi F- in ceppi F+ (i ceppi F- restano tali anche in seguito all’evento di coniugazione con il ceppo Hfr).

Cosa accade nel corso della coniugazione tra una cellula Hfr e una cellula F-?

Nel cromosoma della cellula Hfr si verifica un taglio a singolo filamento in corrispondenza del sito OriT del fattore F integrato. Con la modalità del cerchio rotante, l’estremità 5’ a singolo filamento entra nella cellula ricevente, attraverso il ponte citoplasmatico, trasferendo con sé un frammento del fattore F seguito dal cromosoma batterico. Il restante frammento del fattore F si trova all’estremità 3’ OH del taglio da dove poi parte la replicazione del DNA per sostituire il filamento trasferito. Solitamente la coniugazione si interrompe spontaneamente e quindi solo una frazione di cromosoma batterico viene trasferita. Nella cellula ricevente, il singolo filamento è convertito in una doppia elica di DNA che potrà appaiarsi con la regione omologa del cromosoma batterico e scambiare materiale genetico per doppio crossing-over. Nell’esempio in figura i geni A B e C hanno alleli diversi nel donatore rispetto al ricevente ma, a seguito della ricombinazione, la cellula ricevente che era mutante auxotrofa per i geni A e B è diventata prototrofa per questi geni (è rimasta però auxotrofa per il gene C che non ha ricombinato). Il frammento di DNA lineare, che si è scambiato, viene successivamente eliminato. Negli incroci tra una cellula Hfr e una F- quest’ultima non diventa mai Hfr o F+ questo perché, quando ha inizio il trasferimento, il fattore F si spezza a metà e affinché una cellula diventi Hfr o F+ deve ricevere un fattore F completo e per far sì che questo si verifichi, è necessario che l’intero cromosoma batterico del donatore venga trasferito. Questa circostanza è estremamente rara in quanto, solitamente, la coniugazione si interrompe prima che l’intero cromosoma venga trasferito.

Gli esperimenti di coniugazione sono stati importanti in quanto hanno consentito di stabilire l’ordine e la distanza tra i geni nel cromosoma batterico. Verso la fine degli anni ’50, due ricercatori Jacob e Wollman hanno studiato il trasferimento dei geni tra cellule di E. Coli di un ceppo detto Hfr H e di un ceppo F-. Il ceppo Hfr H era prototrofo per treonina e leucina, sensibile al composto inorganico sodio azide (azoturo di sodio), sensibile all’infezione con il batteriofago T1, capace di crescere utilizzando lattosio e galattosio sensibile all’antibiotico streptomicina. Il ceppo F-, invece, era auxotrofo per treonina e leucina, resistente alla sodio azide e all’infezione del fago T1, incapace di utilizzare lattosio e galattosio e resistente alla streptomicina.

Questi due ceppi vennero mescolati per farli incrociare tra loro e poi, da questa coltura mista, vennero prelevate delle aliquote a diversi intervalli di tempo (dopo 5 min dall’inizio della coniugazione venne prelevato un campione, dopo 6 min dall’inizio un altro campione e così via). I campioni che venivano prelevati erano immediatamente sottoposti ad una breve agitazione che aveva lo scopo di far separare le cellule che erano unite nella coniugazione. Questo procedimento, detto di coniugazione interrotta, aveva lo scopo di bloccare il trasferimento di geni batterici dal donatore al ricevente per capire quali geni del ceppo Hfr H si fossero trasferiti nel ceppo F- in quell’intervallo di tempo considerato. Quindi, ciascun campione che conteneva sia cellule Hfr H che F- veniva piastrato su un terreno contenente streptomicina e privo di treonina e leucina. In questo modo venivano eliminate, dal campione, le cellule Hfr in quanto sono sensibili a questo antibiotico ma anche le cellule parentali F- (che dal genotipo sono auxotrofe per treonina e leucina) neanche loro potevano crescere su questo terreno a meno che non avessero coniugato e ricevuto almeno i geni per treonina e leucina dalle cellule Hfr. Quindi le cellule resistenti, ottenute con questa selezione, vennero piastrate su una serie di piastre contenenti diversi terreni selettivi al fine di identificare i batteri ricombinanti.

In figura sono riportati i risultati dell’esperimento in cui, sul grafico, sull’asse delle x sono mostrati i diversi intervalli di tempo mentre sull’asse delle y la frequenza (in %) dei marcatori genetici provenienti dal ceppo donatore Hfr tra i ricombinanti F-. Nella parte destra della figura sono mostrate le diverse fasi del trasferimento dei geni dal donatore alla cellule F-. Come si vede dal grafico e dal confronto con la figura a destra, nel passaggio 2 (dopo 9 min dall’inizio dell’accoppiamento) si è trasferito il gene che conferisce sensibilità alla sodio azide. Questo significa che (dall’aliquota prelevata dopo 9 minuti) dopo aver eliminato le cellule Hfr con la streptomicina e mantenuto solo le cellule ricombinanti diventate prototrofe per treonina e leucina, comparivano cellule ricombinanti per la sensibilità alla sodio azide. Questo indica che, dopo treonina e leucina, il gene successivo che entra nella cellula ricevente è proprio quello che conferisce sensibilità alla sodio azide. I ricombinanti Ton comparivano dopo 11 minuti seguiti da Lac (dopo 18 minuti) e da Gal (dopo 25 minuti circa). In altre parole, i geni vengono trasferiti dal ceppo Hfr al ceppo F- secondo un ordine ben preciso che è esattamente l’ordine con cui tali geni si trovano sul cromosoma batterico (a partire dal punto in cui inizia il trasferimento cioè il punto in cui localizza il fattore F). Tanto più un gene è lontano dall’origine di trasferimento (oriT) del fattore F tanto più tardi sarà trasferito nella cellula F-. Di solito il trasferimento si interrompe prima che i geni più lontani dall’origine si trasferiscano. Se in condizioni controllate lasciarono andare, per lungo tempo, la coniugazione (circa 2 ore) allora comparvero alcune cellule che si erano convertite in Hfr poiché all’ultimo si trasferiva anche il fattore F che però, in condizioni non sperimentali, è un evento molto raro.

Quando si usarono ceppi Hfr diversi da Hfr H, ad esempio Hfr 1 o Hfr 2, si accorsero che l’ordine di trasferimento dei geni cambiava da un ceppo all’altro. Queste differenze sono spiegabili considerando che il cromosoma batterico è circolare e che il trasferimento dei geni inizia da punti diversi.