Riassunto Genomica umana

Biologia della salute, unibo FMGENOMICA1

Introduzione

Geni → unità fondamentali studiate in biologia, sono segmenti di DNA che producono prodotti funzionali, normalmente delle proteine. Di tali segmenti (e quindi dell’intero genoma, seppur stabile) esistono delle varianti (=mutazioni), che possono andare ad alterare il fenotipo. Solo con Mendel si riuscì a dare un’interpretazione dell’ereditarietà genetica: le caratteristiche genetiche vengono ereditate dai genitori come unità discrete (immutabili).

Per l’analisi genetica si possono utilizzare due approcci: reverse genetics (gene → mutanti del gene → ne studio la funzione osservando le alterazioni fenotipiche) e forward genetics (fenotipo alterato → isolo tali mutanti → identifico anche la funzione). L’analisi genetica viene effettuata su organismi modello (ciclo di vita breve, grandi progenie, facili da gestire; come la Drosophila), mentre sull’uomo la situazione diventa più complessa. Malattie che seguono la segregazione allelica mendeliana sono malattie molto rare e quindi è difficile isolare abbastanza individui per studiarne l’ereditarietà.

Per quanto riguarda i caratteri comuni, questi sono tendenzialmente multifattoriali, ovvero la loro espressione è influenzata dal contributo e interazione di molti geni diversi e vi partecipa anche l’ambiente, influenzandoli. Si capì che anche i caratteri multifattoriali si comportano "a livello microscopico" come i caratteri monogenici, ovvero ogni singolo gene coinvolto si comporterà come un gene mendeliano andando ad influenzare in piccola percentuale con il suo prodotto il carattere risultante finale (tutti i geni singolarmente fanno come quelli di Mendel poi finiscono per influenzarsi tra di loro + contributo ambientale).

Dopo la scoperta della struttura del DNA, del codice genetico e la scoperta del dogma della biologia molecolare (DNA → RNA → proteine), vengono sviluppate nuove tecniche per amplificare (PCR e DNA ricombinante), ibridare e sequenziare il DNA (next generation sequencing) → tecnica meno costosa e più rapida del metodo di Sanger, Moore’s law per spiegare graficamente il rapporto tra aumento della capacità di immagazzinare dati genomici e riduzione del costo di sequenziamento di un genoma.

Confrontando i diversi genomi si è notato che c’è almeno l’1% di varianti, e quindi differenze, tra un individuo e l’altro. Tra queste varianti, buona parte sono varianti comuni che non hanno un effetto sul fenotipo finale (varianti casuali). Ci sono però anche delle varianti, più rare nella popolazione (per via della selezione negativa), che possono determinare l’insorgenza di patologie anche gravi. Tutte queste varianti si è cercato di identificarle e caratterizzarle in diversi progetti come “HapMap”, “gnomAD” e “1000 genomes”.

Nel nostro genoma, dei 3 miliardi di nt, ci sono soltanto 20 mila geni codificanti per prodotti funzionali. Queste porzioni geniche sono ovviamente molto conservate a livello evolutivo, così come le sequenze regolatorie non codificanti (regioni dei promotori, enhancer, silencer).

Per identificare quali siano le varianti più comuni associate a malattie e quali quelle casuali si realizzano degli studi genome wide per associazione (GWAS) → vengono effettuati screening a tappeto di tutto il genoma di un gruppo di casi e di uno di controlli e si vanno ad identificare così quali siano le varianti più comuni nei soggetti affetti da una malattia piuttosto che nei controlli sani.

La genomica è importante anche nell’ambito sanitario, si parla di medicina genomica → per diagnostica (faccio una diagnosi sulla base delle conoscenze genetiche piuttosto che sulla base della sintomatologia) e per trattamento (anche conoscendo se un paziente sia predisposto ad una malattia potrei tuttavia non essere in grado di intervenire). La medicina ha applicazione nella genomica del cancro (sequenzio i genomi delle cellule tumorali per comprenderne le funzioni), nella farmacogenomica (cura personalizzata prevedendo se sarà o meno efficace), diagnosi di malattie genetiche molto rare, screening prenatale non invasivo (oggi sono in grado di rilevare la trisomia 21).

Metodi di amplificazione DNA

• DNA ricombinante → prendo un plasmide a sequenza nota (come quello di E. coli) di cui conosco dunque i segmenti di restrizione. Isolo una porzione di DNA che voglio andare ad amplificare, lo taglio con lo stesso enzima di restrizione che ho usato nel plasmide. I frammenti che ottengo li vado poi ad inserire nel plasmide batterico e con la DNA ligasi saldo il tutto. Il plasmide viene inserito nuovamente nel batterio che si replicherà. I plasmidi sono molecole circolari che si replicano autonomamente rispetto al cromosoma batterico. Hanno un’origine di replicazione, vi posso inserire un marcatore di selezione (per esempio la resistenza agli antibiotici → in questo modo, mettendo la popolazione batterica in un terreno con antibiotico, sopravviveranno soltanto i batteri ricombinanti portatori del marcatore). A differenza dei plasmidi (possono contenere segmenti non troppo lunghi, 5-10 kbp), i vettori di clonaggio potevano contenere sequenze di diversa lunghezza: vettore BAC (200-300 kbp) e vettore YAC (qualche Mbp). Si vanno poi a costituire delle library genomiche con tutti questi segmenti che vengono replicati.
• PCR → a differenza del DNA ricombinante, questa amplificazione avviene in vitro. Devo conoscere la sequenza che vado a replicare perché per effettuare l’amplificazione ho bisogno di primers complementari alle sequenze fiancheggianti la sequenza target. Per far avvenire la reazione di PCR ho bisogno di nt, della Taq polimerasi termoresistente. Ogni ciclo di PCR consiste nella denaturazione del dsDNA ad alte temperature, consiste poi in un riabbassamento della temperatura al fine di permettere l’annealing tra ssDNA e primers presenti in soluzione, segue infine un aumento (di nuovo) della temperatura in modo che la taq polimerasi possa svolgere il suo lavoro, incorporando i nt presenti in soluzione. Ad ogni ciclo di PCR i filamenti presenti in soluzione vengono raddoppiati, questo è un meccanismo veloce ma non quantitativo (va a plateau, si arriva sempre allo stesso massimo a causa dell’usura della Taq polimerasi, del fatto che i primers e i nt finiscano).
• PCR real time → è una PCR che ci permette in tempo reale di monitorare l’andamento della reazione; ci permette di effettuare una stima quantitativa della quantità di DNA che era presente all’inizio (perché ovviamente anche in questo caso si va a plateau); in presenza di sonde fluorescenti posso anche visualizzare il prodotto genico. Il grafico della real time PCR vede una prima fase di latenza e una seconda fase esponenziale che tende ad un plateau. Identificando il ciclo-soglia, ovvero il primo ciclo in cui la crescita comincia ad essere esponenziale (che sarà tanto più precoce quanto più DNA avevo in partenza nel campione), posso fare una stima della quantità di DNA di partenza che avevo. SYBR Green → sonda che diventa fluorescente quando viene incorporata da un dsDNA (anche se incorporata in un dsDNA errato lei da fluorescenza comunque quindi si rischia di avere un segnale errato); si comincia a vedere il segnale, che andrà intensificandosi con il proseguimento dell’amplificazione, dopo 30-40 cicli. Metodo TAQMAN → le sonde sono marcate con un fluoroforo che se libero da un segnale fluorescente e con un Quencher che, finché associato al fluoroforo, fa sì che questo non dia alcuna emissione di segnale. La sonda è complementare al DNA che stiamo amplificando, quando dal primer la polimerasi comincia a replicare il DNA, mano a mano che avanza la sonda viene staccata, liberando il fluoroforo dall’inibizione del quencher → si ha la produzione di un segnale fluorescente molto specifico.

Tecniche di ibridazione

(Usate solo per evidenziare sequenze di nostro interesse). A seconda di quanto imponiamo stringenti le condizioni di ibridazione (temperatura, concentrazione salina) possiamo regolare il livello di match: condizioni di elevata stringenza (alte T, basse [saline]) → l’ibridazione avviene con match perfetti, elevata complementarietà delle sequenze che si appaiano). Tre tecniche:

• Southern Blot
• FISH → questa tecnica di ibridazione si utilizza direttamente “in situ” anche su interi cromosomi: denaturo il DNA in modo da staccare le proteine e renderlo accessibile e con queste sonde fluorescenti possono andare a localizzare specifiche regioni direttamente sui cromosomi metafasici.
• Microarray → ho dei chip con una griglia e all’interno di ciascun “buco” c’è una sequenza nota (per esempio corrispondenti anche a tutti i 20 mila geni umani, il microarray è infatti usato per effettuare più ibridazioni contemporaneamente), aggiungo la mia sonda di interesse marcata con fluoroforo e vado a vedere dove è andata ad ibridarsi.

Tecniche di sequenziamento

• Metodo di Sanger → Utilizzo dei nt normali e dei dideossinucleotidi al 3’ (che mancano del -OH necessario per allungare la catena in formazione → funzionano dunque da terminatori). Il sequenziamento si basa sul fatto che la polimerasi quando allunga la sequenza di DNA stampo (che è stato denaturato a ssDNA) potrà incorporare un nt normale oppure un terminatore che blocca la sintesi. I terminatori sono marcati con una sonda fluorescente, ciascuno di colore diverso in modo da renderli meglio identificabili. La polimerasi produrrà quindi una serie di frammenti di diversa lunghezza che andrò a dividere con elettroforesi. Nei sequenziatori di ultima generazione viene effettuata l’elettroforesi direttamente nel pozzetto dove avviene il sequenziamento attraverso dei capillari. Al termine di tali capillari vi è un laser che identifica quale sia il terminatore aggiunto grazie al segnale fluorescente emesso. Un limite è che posso fare read di al massimo 700 basi, un vantaggio è che ne basta una sola.
• Massively-parallel sequencing → frammento il DNA, attacco degli adattatori, tramite PCR li amplifico, attacco i frammenti su una superficie ed effetto il sequenziamento in parallelo di tutti i frammenti ottenuti. In entrambi i metodi il tutto comincia con la frammentazione del DNA e la creazione di una library. A questi frammenti di 50-300 nt aggiungo degli adattatori che si andranno a legare ad entrambe le estremità. Questo metodo introduce molti più errori rispetto a Sanger ma ogni reads viene fatta più volte: confrontando i risultati ottenuti dal sequenziamento posso andare ad identificare sequenze consensus (elimino gli errori random). Effettuo un controllo qualità delle mie sequenze ottenute: devo avere un quality score di almeno 30 (1 errore ogni 1000 nt incorporati). Procedo poi all’assemblaggio dei frammenti sulla base delle regioni di sovrapposizione: l’assemblaggio può essere de novo (problemi in caso di sequenze ripetute, per esempio) oppure viene effettuato basandosi su un genoma di riferimento. Il coverage sta a significare le volte in cui un dato nt è rappresentato nella sequenza ricostruita.
• Ion torrent → ottenuti i frammenti con adattatori, effettuo Emulsion PCR. I frammenti vengono uniti a delle beads a cui sono attaccati degli adattatori complementari a quelli legati anche ai frammenti che sto amplificando. L’obiettivo è quello di avere all’interno di ogni gocciolina in emulsione una beads con un solo tipo di frammento. Effettuo a questo punto la PCR: la duplicazione del filamento avviene a partire dall’adattatore (complementare a quello attaccato alla bead) che funge da primer, segue poi la replicazione di tutto il frammento al termine della quale si ha denaturazione e resterà attaccato solo il filamento nuovo. Con il secondo ciclo di PCR, l’amplificazione avverrà sia come spiegato prima, sia a partire dall’adattatore complementare a quello che non si trova legato alla bead nel frammento prima sintetizzato (che sta quindi attaccato). Al termine della PCR, procedo con il sequenziamento. Il metodo utilizzato sfrutta il fatto che ad ogni nt incorporato la polimerasi rilascia H⁺ e PPi. Il pyrosequencing sfrutta il pirofosfato liberato: questo viene rilevato tramite una reazione enzimatica che impiega la luciferasi. Per sequenziare, faccio passare in ordine i 4 nt finché non ottengo un segnale che sta a significare che ho aggiunto quello complementare ed è stato rilasciato PPi. In alternativa mi baso sulle leggere variazioni del pH dovute all’incorporazione di un nt. Anche in questo caso, alla polimerasi fornisco un nt alla volta finché col pHmetro non rilevo una variazione del pH.
• Illumina → la PCR la effettuo mediante la bridge amplification. Su una superficie solida (vetrino, flowcell) vengono fatti aderire degli adattatori di due tipi diversi, complementari a quelli che stanno attaccati al nostro frammento. Effettuo la denaturazione del nostro DNA, si ha poi l’annealing tra segmento da amplificare e primer attaccato al vetrino. La polimerasi effettua la sintesi del nuovo filamento che resterà attaccato al vetrino. Con il successivo ciclo di denaturazione, il filamento stampo si stacca. Segue l’annealing che per il filamento attaccato al vetrino funziona in modo particolare: si forma un ponte (il filamento si piega per legarsi con l’adattatore complementare a quello presente all’estremo libero) e la polimerasi replica il filamento. Denaturando si ottengono due filamenti complementari e attaccati entrambi al vetrino. Si formeranno dei cluster. Per il sequenziamento si usano dei nt modificati che hanno attaccato un marcatore fluorescente e un blocco al 3’. In questo modo, la polimerasi li incorpora (e io ne vedo il segnale fluorescente) ma è costretta a rallentare a causa del blocco (controllo la velocità di sintesi). Con il clivaggio viene rimosso il blocco al 3’ e si prosegue con la sintesi.
• Single molecule sequencing → sequenzio direttamente una catena anche molto lunga (non ho quindi bisogno della PCR e mi svincolo dunque da tutti quegli errori che possono essere commessi dalla polimerasi e sono in grado di sequenziare anche sequenze difficili, tipo con ripetizioni in tandem) e leggo in tempo reale la sequenza. Sono in grado di identificare varianti strutturali e basi modificate. Questa tecnica la stanno sviluppando due compagnie: Pacific Biosciences (pyrosequencing per la rilevazione del segnale) e Oxford Nanopore (variazioni nelle correnti elettriche permettono di rilevare un segnale diverso a seconda del blocco di nt, circa 4-5 nt, che è stato incorporato).

Con il progetto genoma umano (shotgun gerarchico) e con Celera (shotgun dell’intero genoma) è stato sequenziato per la prima volta l’intero genoma umano. Il sequenziamento è stato fatto con metodo di Sanger su vettori ricombinanti in cui erano stati aggiunti i frammenti genomici. Il vantaggio dell’usare questi vettori sta nel fatto che posso usare primer universali, complementari a sequenze note vettoriali (altrimenti dovrei già conoscere la sequenza che ho inserito nel vettore e il problema sta proprio nel fatto che è lì perché la voglio sequenziare). Procedo poi con Sanger e le sequenze ottenute le confronto sulla base delle regioni di omologia; il coverage indica il numero di volte in cui appare un dato nucleotide.

Annotazione del genoma

A questo punto, una volta sequenziato il genoma, procedo con la sua annotazione, ovvero vado ad identificare i geni. Posso o basarmi sulla presenza di ORF abbastanza lunghe, su sequenze consensus abbastanza conservate (le regioni codificanti sono infatti quelle più conservate poiché sottoposte a maggiore pressione selettiva, le identifico perché sono molto lunghe, non presentano codoni di stop al loro interno e sono conservate; anche le regioni di splicing sono state conservate evolutivamente e sono più corte delle sequenze codificanti). Se devo sequenziare le regioni non codificanti è più difficile poiché queste non sono sottoposte alla stessa pressione selettiva che vige nelle regioni codificanti e pertanto saranno altamente polimorfiche nella popolazione (tanti codoni di stop); difficile è anche codificare quelle regioni non codificanti ma che hanno un ruolo nella regolazione dell’espressione genica (promotori, enhancer e silencer). In alternativa posso andare, con l’RNA-seq, a retrotrascrivere i trascritti a RNA (solo esonici, quindi) ottenendo dei cDNA (DNA complementari). Sequenziando questi cDNA ottengo delle informazioni anche sull’esoma umano (mRNA da cui ottengo cDNA è composto da soli esoni, gli introni vengono tagliati via con splicing). Il terzo approccio sfrutta l’elevata conservazione a livello evolutivo delle sequenze codificanti e regolatorie. Si è visto che ben il 5% del genoma si è conservato nel corso dell’evoluzione dei mammiferi. Di questo l’1,5% codifica per proteine e il 3,5% è rappresentato da elementi di regolazione dell’espressione genica (ncRNA). Il 6,7% è rappresentato da eterocromatina (DNA molto ripetuto, condensato), il 45% da sequenze ripetute intersperse (derivate da elementi di trasposizione) e il 44% del genoma è rappresentato da sequenze uniche delle quali una parte sarà funzionale e una ancora non si sa.

I ncRNA sono appunto degli RNA che vengono trascritti ma non daranno origine ad un prodotto proteico funzionante, hanno un ruolo nella regolazione dell’espressione genica. Tra questi distinguiamo quelli piccoli, come i miRNA, e quelli lunghi, come il gene XIST coinvolto nell’inattivazione del cromosoma X.

Gli eventi di duplicazione hanno avuto un ruolo fondamentale nell’evoluzione; possono interessare interi genomi.