Riassunto esame Analisi dei farmaci biotecnologici, prof. Regazzoni

Analisi dei farmaci biotecnologici

Analisi: studio e dello sviluppo dei metodi mediante i quali si possono individuare le specie chimiche presenti in un campione di materia e determinarne le quantità.

Analisi qualitativa: identificazione e caratterizzazione del farmaco relativamente sia alla struttura chimica sia allo stato fisico.

Analisi quantitativa: determinazione della quantità di una o più sostanze note (analiti) di un campione.

Matrice: ambiente in cui è disperso l’analita.

L’insulina è il primo farmaco ottenuto attraverso l’ingegneria genetica.

La maggior parte dei biofarmaci utilizzati ad oggi nella pratica clinica sono proteine terapeutiche come anticorpi monoclonali, citochine, ormoni, proteine di fusione. Molti di questi agiscono come modulatori della risposta infiammatoria e/o immunitaria.

La struttura molecolare dipende dal processo, cioè il processo produttivo determina l’unicità del prodotto.

I farmaci prodotti in laboratorio solitamente hanno un peso molecolare inferiore ai 600 Dalton. I farmaci biotecnologici, per la variabilità intrinseca e per la complessità delle tecniche di produzione, sono particolarmente difficili da caratterizzare e produrre. E la difficoltà cresce proporzionalmente alla complessità della molecola originatrice.

Dopo la traduzione una proteina viene (solitamente) ulteriormente modificata dalla cellula:

• Taglio/rimozione peptide segnale
• Glicosilazione
• Solfatazione, amidazione, ecc.

Necessario un corredo enzimatico specifico:

• Assente nelle cellule procariotiche
• Specifico per ciascuna linea cellulare eucariotica
• Non (necessariamente) sotto il controllo del gene interessato
• Dipendente da linea cellulare di produzione e condizioni di coltura

Anche la glicosilazione è un fenomeno complesso: esistono varie forme di glicosilazione.

• Pattern glucidico

Micro-eterogeneità glicomica.

Capacità posseduta da una sostanza di indurre una risposta immunitaria. In generale, con questo termine si indica la proprietà di una molecola di stimolare il sistema immunitario senza il supporto di un’altra molecola adiuvante.

Anticorpi monoclonali coniugati: ADC

Come creare tali costrutti? Ci sono 3 strategie.

1. Utilizzare punti di ancoraggio alcuni amminoacidi che espongono caratteristiche chimiche peculiari (es. cisteina presenta un tiolo).
2. Coniugazione sitospecifica su amminoacidi non naturali.

Controllo se tutto il farmaco si è legato al drug.

Quantità di farmaco non coniugato importante per la sicurezza e per la stabilità del prodotto. Dopo la coniugazione non ci deve essere farmaco libero e il linker non deve rilasciare il farmaco nel tempo ma solo al sito bersaglio in seguito a somministrazione.

Controllo anche dov’è distribuito il citotossico, il DOP influenza l’omogeneità del prodotto, una distribuzione eterogenea potrebbe portare problemi legati alla diversa farmacocinetica e tossicologia dei diversi coniugati. Le cisteine hanno una distribuzione più prevedibile rispetto alle lisine concentrate a livello delle catene pesanti e leggere dove formano ponti disolfuro.

Controllo reazioni di coniugazione (reazioni di precipitazione dopo iniezione): si ha una determinazione del peso molecolare che è importante per stabilire l’identità del prodotto e l’assenza di aggregati ad alto peso molecolare (la presenza di sostituzioni annulla le cariche e favorisce l’aggregazione).

Controllo anche delle tecniche separative per stabilire il punto isoelettrico del prodotto. Modifiche che influenzano la carica complessiva (coniugazione con il farmaco, deamidazione, glicazione) possono influenzare il binding, la stabilità e l’attività. Sono tracciate mediante cromatografia e scambio ionico o l’isoelettrofocusing capillare o su membrana.

Controllo anche il DAR ovvero il numero medio di molecole di farmaco coniugate all’anticorpo. Fondamentale per la sicurezza e l’efficacia della preparazione in quanto determina il “payload” distribuito al bersaglio.

Faccio anche un sequenziamento e mappatura delle modifiche post-traduzionali. È importante per stabilire mediante caratteristiche strutturali importanti (ponti disolfuro, siti di coniugazione e glicazione, modifiche post-traduzionali, ecc.), l’identità dell’anticorpo e la riproducibilità del processo di produzione.

Cromatografia

Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento (analisi qualitativa) e il dosaggio (analisi quantitativa).

Queste tecniche sono basate sulla differente ripartizione o diffusione o interazione (in base al tipo di cromatografia si sfruttano differenti principi chimico-fisici) di molecole con diverse proprietà chimico-fisiche (dette analiti) fra due fasi, una chiamata fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso (o a contatto con) la fase fissa.

• Possono essere usate per fini separativi (purificazione, frazionamento) o per fini analitici. Le analisi sono (quasi) sempre distruttive in quanto gli analiti vengono solitamente (ma non sempre) distrutti dal detector.
• Le tecniche cromatografiche operano esclusivamente su campioni in soluzione o in fase vapore: i materiali oggetto di analisi vanno quindi disciolti in un opportuno solvente. Non è possibile l’analisi senza prelievo di campione né tanto meno l’analisi in situ.
• Con i moderni strumenti il consumo di campione è minimo. Sono sufficienti da 1 ml a 1 µl di soluzione, corrispondenti a meno di 1 mg di campione solido.

Basi del procedimento cromatografico

• La fase mobile (o eluente in forma di gas, liquido o fluido supercritico) viene fatta eluire in continuo attraverso (o a contatto con) la fase stazionaria, che si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana ed è immiscibile nell’eluente.
• Il campione è introdotto nella fase mobile e da essa trasportato attraverso (o a contatto con) la fase stazionaria.
• I componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema (maggior ritenzione).
• I componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente (minor ritenzione).

Origini della tecnica

• Inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett agli inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari.
• Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio ed eluì, cioè versò in continuo, con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla.

Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco “scrittura del colore”.

Classificazione delle tecniche cromatografiche

Criterio 1: in base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia liquida (LC): eluente allo stato liquido.

• Campione introdotto in forma di soluzione diluita.
• La più diffusa, applicata in tutti i campi compreso l’analisi di proteine, peptidi e prodotti biotecnologici.

Gascromatografia (GC): eluente allo stato gassoso.

• Campione introdotto in forma di gas o soluzione diluita che viene vaporizzata prima di entrare nel flusso dell’eluente.
• Molto diffusa per analisi di molecole volatili, scarse applicazioni per l’analisi di prodotti termolabili tra cui proteine, peptidi e prodotti biotecnologici.

Cromatografia fluida supercritica (SFC): eluente allo stato fluido supercritico.

• Tecnica emergente per l’analisi di piccole molecole, scarse applicazioni per l’analisi di proteine, peptidi e prodotti biotecnologici.

Criterio 2: in base al principio su cui si basa la separazione

Adsorbimento

• Differente capacità degli analiti di instaurare interazioni deboli (dipolo-dipolo, legami idrogeno, interazioni idrofobiche) con la fase stazionaria (solida).

Ripartizione

• Differente diffusione degli analiti tra fase mobile e stazionaria (liquida).

Scambio ionico

• Differente capacità degli analiti di instaurare interazioni ioniche deboli (legame ionico) con la fase stazionaria (liquida).

Affinità

• Interazioni deboli specifiche (tipo farmaco-recettore) della fase stazionaria (liquida) con analiti o classi di analiti specifiche.

Esclusione

• Nessuna interazione degli analiti con la fase stazionaria ma diversa “accessibilità” alla fase stazionaria dovuta ad ingombro sterico.

Adsorbimento

La fase stazionaria è un solido in granuli e la fase mobile può essere un gas o un liquido. La fase stazionaria è in genere un composto inorganico o un polimero organico. Sulla superficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possono stabilire legami deboli (interazioni dipolo-dipolo, legami idrogeno, interazioni idrofobiche) con gli analiti.

Sulla superficie dell’allumina sono presenti dei dipoli (cariche positive e negative) possiamo avere dei legami di coordinazione con gruppi amminici, interazioni dipolo-dipolo con gruppi carbossilici o interazioni idrogeno con ossido di alluminio.

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido (supportato da un solido granulare inerte). La fase mobile può essere un gas o un liquido e comunque deve essere immiscibile con la fase liquida. Durante l’eluizione gli analiti si ripartiscono (diffusione) nelle due fasi sulla base delle caratteristiche fisico-chimiche (logP, pKa).

A seconda della natura della fase stazionaria e mobile la cromatografia di ripartizione si definisce:

• In fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile.
• In fase inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile.

La cromatografia in fase inversa è più comune visti i bassi costi e la bassa tossicità legata all’impiego di solventi polari (acqua, alcoli, acetonitrile sono i solventi più comuni).

La ripartizione degli analiti dipende anche dalle loro costanti di dissociazione acida (sarebbe più corretto parlare di distribuzione tra le fasi). Esempio di cromatografia in fase inversa con fase mobile acquosa di un analita acido HA:

Scambio ionico

La fase stazionaria è costituita da macromolecole con gruppi ionici, cationici o anionici (es. R-NH3+, R-SO3-) in grado di trattenere analiti carichi (con carica di segno opposto) che possono essere poi eluiti per spiazzamento (scambio) con ioni della stessa carica presenti nella fase mobile. La ritenzione dipende dalla forza delle interazioni ioniche che si instaurano tra gli analiti e la fase stazionaria.

La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la separazione di sostanze ioniche o ionizzabili.

Affinità

Si utilizzano interazioni deboli simili a reazioni di tipo biochimico reversibili e molto specifiche (es. antigene-anticorpo, farmaco-recettore), in modo che le molecole da separare interagiscano selettivamente con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela.

La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico.

Esclusione

Tecnica per la separazione di molecole in base alle dimensioni (raggio idrodinamico).

La fase stazionaria è un solido poroso o, più comunemente, un gel con pori di dimensioni variabili. Analiti con raggio idrodinamico inferiore al diametro dei pori penetrano nei pori stessi, seguendo un percorso più lungo rispetto a molecole troppo grandi che vengono “escluse” (da qui il nome cromatografia di esclusione) dai pori e perciò escono dalla colonna in tempi inferiori (tragitto più breve).

Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (size exclusion chromatography, SEC).

• Gel permeazione per la separazione di sostanze insolubili in acqua.
• Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua.

Questa tecnica ha la capacità di separare molecole che hanno una differenza di peso molecolare nell’ordine dei 10 Kda.

La separazione non si basa su interazioni della fase stazionaria con gli analiti che deve, anzi, essere evitata modificando la fase mobile (es. pH, forza ionica) per impedire interazioni ioniche o apolari.

I principi che si sfruttano per i prodotti biotecnologici sono:

1. Adsorbimento per prodotti apolari insolubili in acqua, nessun esempio in ambito biotecnologico.
2. Ripartizione per prodotti polari non ionici come peptidi con amminoacidi neutri o alicosilati.
3. Scambio ionico per prodotti polari ionici come proteine o peptidi con amminoacidi basici o acidi.
4. Esclusione per prodotti con alto peso molecolare come le proteine.
5. Affinità per prodotti cui si può disegnare un supporto avente interazioni deboli specifiche come gli anticorpi.

La fase stazionaria

Il supporto più comune alla fase stazionaria è costituito da particelle sferiche microporose di silice.

La silice non può essere usata con fasi mobili basiche (pH>8-10) o eccessivamente acide (pH<1-2) in quanto si scioglie.

I materiali polimerici recentemente introdotti come supporto (es. polistrirene o grafite) sono più stabili a condizioni estreme di pH e temperatura.

Le particelle di gel di silice possono costituire la fase stazionaria per la cromatografia a fase normale, esclusione molecolare e di adsorbimento oppure essere il supporto per le fasi legate (fase inversa, scambio ionico, affinità).

La fase normale su gel di silice

• Silanoli liberi: mediamente acidi, a pH 2-3 sono completamente protonati; a pH>3 si dissociano a gruppi Si-O e possono interagire con composti basici.
• Silanoli geminiali e viciniali: non acidi possono interagire con composti idrofili (ripartizione in fase normale).
• Silanoli derivatizzati: consentono di cambiare le modalità di interazione (scambio ionico, ripartizione, ecc.) o la selettività verso particolari analiti (es. scambio ionico acido/basico).

Alcune derivatizzazioni consentono di realizzare fasi stazionarie che sfruttano diversi principi con interazioni miste o mixed mode (ripartizione in fase inversa + scambio ionico).

Fase stazionaria con meccanismo misto

Cromatografia ad interazione idrofilica (HILIC)

• Eccellente ritenzione di molecole idrofile ed eluizione con solventi da fase inversa (meno costosi e tossici).
• Recente utilizzo per la separazione di biopolimeri.

Materiali ad accesso ristretto (restricted access materials, RAM)

• Si basano su 2 principi: esclusione molecolare + interazione (es. affinità, scambio ionico, ripartizione).
• Le macromolecole non interagiscono con la fase stazionaria e sono escluse (non ritenute).
• Le piccole molecole accedono a dei pori funzionalizzati per trattenere classi specifiche di analiti (in base a ripartizione o scambio ionico ecc.) che possono essere eluite in seguito modificando la fase mobile per rompere le interazioni.

Criterio 3: in base alla forma del letto cromatografico

Cromatografia su colonna (impaccata, monolitica o capillare)

• La fase stazionaria è contenuta all’interno di un tubo cilindrico (colonna), che può essere riempito con materiale sferoidale di fase stazionaria (colonna impaccata), essere rivestito (colonna capillare) oppure contenere un unico blocco di materiale poroso (colonna monolitica).
• Manuale o strumentale, usata per fini sia analitici, sia preparative.

Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)

• La fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su strato sottile, TLC).
• Manuale, usata per analisi semplici e veloci.

Cromatografia planare

Le fasi stazionarie più usate sono: il gel di silice e l’allumina per la cromatografia di adsorbimento (thin layer chromatography, TLC); la cellulosa per la ripartizione liquido-liquido (paper chromatography, in questo caso la fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle particelle di cellulosa).

Il risultato è visualizzabile sotto forma di macchie colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire per confronto con miscele standard; in questo caso il parametro che caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o fattore di ritenzione. Per ogni analita il valore di Rf si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro della macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell’eluente:

Rf = d / d analita eluente

Il valore di Rf degli analiti è quindi sempre compreso tra 0 e 1.

I valori ottimali sono compresi tra 0.4 e 0.8.

Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a due metodi per visualizzare il risultato della separazione:

1. Utilizzare una lampada UV per irraggiare la lastrina, se le sostanze separate non assorbono la luce visibile ma assorbono nell’ultravioletto (l< 400 nm); può essere necessario addizionare alla fase stazionaria o alla fase mobile un indicatore di fluorescenza che permette di localizzare le