Riassunto biochimica - modulo 2 completo

Riassunto biochimica modulo 2

Biochimica alimentare

Si occupa di controllare le interazioni all'interno di un alimento:

Interazioni tra proteine e ambiente

Sono normalmente non covalenti e quindi deboli e dipendono in minor parte dalla sequenza degli amminoacidi e in maggior parte dalla struttura tridimensionale assunta dalla proteina. Condizionano le trasformazioni a carico degli alimenti e quindi anche la conservabilità o la consistenza.

Interazioni tra gruppi diversi di proteine

Possono essere sia covalenti che non covalenti e determinano la struttura del prodotto (impasti).

• Interazioni tra proteine e amido
• Interazioni tra proteine e lipidi
• Interazioni tra amido e lipidi: sono normalmente interazioni non covalenti importanti nella definizione della qualità di un pane.

Descrivere le varie interazioni serve sia per capire le cause del manifestarsi di inconvenienti durante il processo produttivo e anche per utilizzare metodi meno perturbanti possibile per l’alimento.

L'acqua

Solvente:

• Scioglie e tiene in soluzione piccole molecole, condizionando tutti gli equilibri osmotici, il pH e i cambiamenti di stato. Funge anche da solvente per le macromolecole, per le quali ne determina la solubilità.

Strutturante:

• Il tipo di solvente determina la struttura di una macromolecola in esso (es. una proteina tende a mantenere la parte idrofilica verso l'esterno) e anche di una piccola molecola (es. una vitamina). Questo effetto strutturante condiziona la biodisponibilità di una molecola, poiché, ad esempio, alcune componenti sono associate non covalentemente alle proteine e quando queste cambiano la loro struttura esse non sono più associate; ed inoltre se cambio una struttura cambio anche il ruolo dell'acqua, e ciò modifica la holding capacity (capacità di trattenere acqua).

Mezzo di reazione:

• L'acqua è indispensabile per certi enzimi o certi microrganismi. L'acqua negli alimenti è di 4 tipi e il tipo di acqua in un alimento definisce la capacità di trattenere l'acqua delle macromolecole. Il tipo di acqua in un alimento è definito anche la mobilità dell'acqua:
• Tipo IV: Acqua pura, con aw =1. È quella che importa meno dal punto di vista delle modifiche strutturali.
• Tipo III: Acqua libera, con aw =0,8/0.9. Regola la crescita microbica, le attività enzimatiche, le manifestazioni di trattamento termico (imbrunimento non enzimatico), reazioni idrolitiche ed ossidative.
• Tipo II: Acqua coordinata, con aw =0,8/0,25. Regola le attività enzimatiche, le reazioni ossidative e l'imbrunimento non enzimatico.
• Tipo I: Acqua legata, con aw =0,25/0. Non congela mai e non viene tolta nemmeno con l'essiccazione e consente la compartimentalizzazione. Buona parte delle trasformazioni riducono in gran parte l'acqua di tipo III.

Le proteine

Interazione tra acqua e proteine

La proprietà che condiziona questa interazione è la solubilità. Una proteina può cambiare la sua solubilità in funzione:

• Della forza ionica (presenza di Sali), la quale se aumenta posso rendere insolubili delle proteine o solubilizzarne altre
• Del pH (punto isoelettrico = proteina insolubile)
• Del ruolo dei metalli (soprattutto bivalenti)

Il cambiamento della solubilità può essere accompagnato dalla modifica della struttura nativa della proteina. Se una proteina precipita (diventa insolubile) mantenendo la sua struttura nativa, il processo è reversibile.

Classificazione in base alla solubilità

• Citoplasmatiche: Albumine: solubili in soluzione acquosa (sieroalbumina e lattoalbumina). Globuline: solubili in soluzioni saline come le viciline, le legumine, le immunoglobuline.
• Di riserva: Solubili in soluzioni alcoliche: sono le prolamine (nel frumento le gliadine). Gluteline: solubili in soluzioni debolmente acide o debolmente alcaline (nel frumento sono le glutenine).
• Scleroproteine: Non solubili in nessun mezzo, presenti in molti semi.

La forza ionica

Una proteina in dipendenza dal mezzo in cui si trova presenta una carica netta ben definita. Proteine della stessa specie hanno la stessa carica e quindi tendono a respingersi, condizione nota come salting-in, in cui la proteina risulta solubile. Aggiungendo un sale (es. NaCl), questo interagisce con l'acqua libera intorno alla proteina e oltre ad una certa concentrazione:

• Na+ si avvicina alle cariche negative della proteina schermandone le cariche superficiali, determinando una carica diversa nelle proteine, le quali cominciano ad aggregarsi.

La proteina tende ad associarsi mediante interazioni elettrostatiche idrofobiche, andando a formare un polimero proteico che tende a precipitare, fenomeno noto come salting-out. Questo fenomeno non provoca un cambiamento della struttura nativa della proteina, ed è un fenomeno reversibile. È un sistema utilizzato per conservare l'attività di molti enzimi poiché una proteina in un polimero ha meno gradi di libertà e quindi è meno probabile che assuma una struttura denaturata. Ogni gruppo di proteine ha un comportamento diverso per quanto riguarda la variazione di solubilità in funzione della variazione della forza ionica e questo sta alla base della separazione di due frazioni proteine (es. separazione degli anticorpi dal sangue, al quale aggiungo solfato di ammonio, che fa precipitare le immunoglobuline; rimangono solubili le sieroalbumine). Quindi una stessa concentrazione di Sali diversi, porta ad una diversa solubilità della proteina, perché la forza ionica è diversa.

In altri casi, anche se la forza ionica di due Sali è la stessa, la solubilità della proteina può variare e ciò dipende dallo ione che compone il sale (es. Na+ è monovalente; Ca++ è bivalente).

Sali che modificano la struttura nativa della proteina

Classificazione del chimico tedesco Hofmeister:

• Sali strutturanti: Sali liofilici, ovvero altamente solvatanti in soluzione, che agiscono schermando debolmente le cariche superficiali delle proteine. Sono normalmente Sali grossi.
• Sali destrutturanti: Lipofilici, sono molto piccoli e non hanno una solvatazione elevata, quindi possono agire sulle cariche superficiali, ma penetrano anche all'interno della proteina, rompendo le coppie ioniche che stabilizzavano la struttura.

Ruolo del pH

Il punto isoelettrico di una proteina è il valore di pH al quale quella proteina ha carica netta uguale a zero e quindi tende ad associarsi (ho il minimo valore di solubilità). Quindi se ho delle variazioni di solubilità legate ad una diversa schermatura delle cariche superficiali vuole dire che ho aggiunti ioni che variano il pH e può succedere che queste schermature determinino un cambiamento della struttura.

Ruolo dei trattamenti

Un trattamento può comportare una modifica della solubilità, legata all'assunzione di una nuova struttura. Esempio: se il latte crudo lo porto a pH 4,6 le sieroproteine sono tutte solubili. Il trattamento termico denatura le sieroproteine, le quali saranno meno solubili a pH 4,6 (in un latte UHT le sieroproteine saranno tutte insolubili). Alcuni formaggi, caratterizzati da un processo di acidificazione (produzione di lattato ad opera di microrganismi) hanno come obbiettivo la variazione della solubilità delle caseine. Un formaggio la cui variazione della solubilità proteica è fatta tramite il calore è la ricotta. Una variazione della solubilità proteica tramite l'utilizzo di enzimi, che va anche a modificare drasticamente la struttura proteica viene fatta nella birra, idrolizzando e rendendo più solubili le proteine della birra tramite proteasi, evitando la torbidità.

Applicazione di variazioni della solubilità in alimenti

Formazione di gels

Un gel è una sostanza che evidenzia proprietà simili ad un sistema solido e che ha la capacità di trattenere grandi quantità di solvente. Nel caso di gels proteici: si tratta di una modificazione strutturale delle proteine con conseguente formazione di aggregati con grande capacità di trattenere acqua. I gels proteici hanno un impatto sulle proprietà reologiche e sensoriali (texture) del prodotto e possono essere classificati in base alle interazioni che caratterizzano le proteine e in base alla reversibilità.

Gel stabilizzato da interazioni H

• Si tratta della gelificazione del collagene, una struttura proteica di idrossiprolina ad elica stabilizzata da interazioni covalenti e legami H. Quando fornisco calore, la proteina si solubilizza e vengono rotte tutte le interazioni H, ma non i legami covalenti. Nel momento in cui la gelatina si raffredda le proteine denaturate (aperte) formano nuove interazioni H tra di loro e con il solvente. La libertà di formare queste interazioni è inversamente proporzionale alla quantità di legami covalenti (uso la gelatina di pesce o di animali giovani perché meno ricca di interazioni covalenti e quindi lega meglio con l'acqua). I legami H si formano quando la proteina non è in agitazione. Il gel è reversibile.

Gel stabilizzato da interazioni elettrostatiche

• Le proteine della soia, isolate, non hanno una texture che le rende mangiabili, ma essa può essere migliorata andando a trattare con ioni di Ca++, perché queste proteine sono acide e quindi ricche di gruppi carichi negativamente (aspartato, glutammato) e lo ione Ca++ fa da ponte tra le catene proteiche e forma un reticolo. Ho trasformato proteine acide immangiabili in un gel mangiabile. È possibile anche con un altro ione bivalente, come il Mg++ che però è amaro. Questo gel è irreversibile.

Gel stabilizzato da interazioni idrofobiche

• Il siero del latte è formato da acqua, lipidi residui, lattosio e sieroproteine (a-lattoalbumina e b-lattoglobulina). Il siero viene acidificato debolmente e scaldato a 90°C e ciò comporta una denaturazione delle proteine che diventano insolubili e tendono ad associarsi formando un reticolo, stabilizzato da interazioni elettrostatiche, idrofobiche ed idrofiliche (legami H). Acidificando vado a toccare la protonazione dei gruppi carichi e favorisco l'interazione tra gruppi che prima non potevano interagire. Questo tipo di interazione è irreversibile.

Gel stabilizzato da interazioni covalenti

• L'albume d'uovo è composto per l'80% da acqua e per il 20% da proteine, delle quali l'80% è ovoalbumina, una proteina costituita da un monomero, che quando cristallizza forma tetrameri e che nella sua forma nativa ha ponti disolfuro intracatena. L'ovoalbumina ha quindi interazioni idrofobiche e ponti disolfuro, ma all'interno della sua struttura proteica è presente anche un residuo di cisteina -SH facilmente ossidabile (una volta ossidato non è più biodisponibile). Scaldando l'albume la proteina si denatura ed espone il residuo di cisteina, che va ad interagire con un gruppo S-S intracatena, determinando uno scambio di disolfuri e creando un ponte disolfuro intercatena. È indispensabile che la proteina sia ricca di residui cisteinici e che tale numero sia dispari. È un processo irreversibile.

Gel stabilizzato da interazioni elettrostatiche ed idrofobiche

• Queste interazioni sono a carico della caseina. Normalmente la caseina è formata da circa 200 amminoacidi, la cui incidenza è maggiore per la prolina (causa una poca organizzazione della struttura, non permettendo l'assunzione di una struttura secondaria e creando punti di rigidità). Nella caseina si ha anche una distribuzione abbastanza uniforme di residui idrofobici (in ambiente idrofilico, per essere solubile deve disporsi con questi residui non esposti) e ha una serie di residui di serina che possono andare incontro a modificazioni post-traduzionali, a glicosidazione o a fosforilazione (vengono aggiunti gruppi carichi negativamente).

Esistono 4 famiglie diverse

• B-caseina: ricca in residui idrofobici e le zone fosforilate sono ben posizionate in una piccola porzione (è la più idrofobica).
• As1-caseina
• As2-caseina
• K-caseina: nella parte C-terminale ha residui di treonina glicosilati.

La y-caseina viene indicata spesso come un'altra famiglia, ma in realtà si tratta di un frammento di b-caseina (deriva dalla sua idrolisi). Ogni famiglia è caratterizzata da un polimorfismo esteso, ossia da diverse variabili di caseina. In acqua queste quattro proteine, dette submicelle, tendono ad associarsi a formare una micella di caseina. Nella micella le parti idrofiliche sono esposte e interagiscono con il solvente e le submicelle sono disposte per idrofobicità. Dall'interno verso l'esterno troviamo: b-caseina, as1 e as2-caseina associate, k-caseina.

Sistemi per alterare la struttura della caseina

• Il sistema più semplice per perturbare questa struttura è acidificare, poiché cambio le interazioni elettrostatiche e quindi il Ca++ si lega di meno e la struttura tende a precipitare, ottengo lo yogurt.
• Diminuendo la disponibilità del calcio produco formaggi adatti ad essere fusi. Per legare il calcio uso agenti di fusione (chelanti). Una volta venivano usati i polifosfati, ma ora sono stati proibiti perché legavano talmente bene il calcio da non renderlo più disponibile. I polifosfati sono stati sostituiti dal citrato. (un formaggio adatto da fondere ha maggior contenuto di acqua e se scaldato diventa marrone).
• Un altro modo per alterare la struttura della caseina è intervenire enzimaticamente. Posso intervenire con enzimi generici ottenendo tanti piccoli peptidi, oppure posso utilizzare un enzima specifico, dando origine ad un coagulo, ottenendo i formaggi. La chimosina taglia specificatamente al residuo 105-106 (Phe-Met) della K-caseina, che sta nella zona C-terminale e ciò fa perdere alla k-caseina la sua zona idrofilica e quindi la micella espone le zone idrofobiche e tende a raggiungere l'equilibrio associandosi idrofobicamente tramite le nuove zone esposte. Questo coagulo tende a compattarsi sempre di più e quindi occorre intervenire con la rottura del coagulo. Per la formazione del coagulo è indispensabile che la proteina si trovi nella forma nativa (nel latte UHT la micella ha la struttura quaternaria modificata e può fare scambi disolfuri con la b-lattoglobulina e quindi non si può idrolizzare la k-caseina e non si forma il coagulo. Se scaldo però blandamente in caldaia il latte crudo prima della caseificazione mi si formano pochi legami con la b-lattoglobulina e quindi mi viene preclusa l'azione dell'enzima e ciò aumenta la resa di caseificazione. Il latte per il consumo umano non va bene per la caseificazione perché omogeneizzato e ciò evita la separazione delle fasi perché altera la struttura dei globuli di grassi e delle micelle.

Interazione con piccole molecole

Le proteine possono fungere da trattenitori di aromi tramite legami idrofobici in un core specifico della proteina. Per permettere questa funzione non è indispensabile che la proteina sia solubile, ma è indispensabile che la struttura non venga alterata. Esempio: la sieroalbumina ha un solco idrofobico che ha la funzione di legare gli acidi grassi nel sangue (lega anche acqua e aromi). Le proteine e la loro proprietà di legarsi attraverso interazioni idrofobiche con i polifenoli (soprattutto antociani) vengono sfruttate per operazioni di chiarifica dei prodotti enologici. Questa operazione permette di migliorare le caratteristiche astringenti e quindi eliminare i tannini, aumentare la stabilità dei vini bianchi controllando l'imbrunimento e la polimerizzazione dei polifenoli e di facilitare la filtrabilità. Le proteine migliori per queste operazioni sono le sieroalbumine. Nella scelta della famiglia adatta di proteine esse devono avere una zona idrofobica superficiale che abbia una buona affinità verso i polifenoli. L'idrofobicità viene misurata andando a vedere che l'interazione tra proteine e polifenoli comporta una diminuzione di fluorescenza (se aggiungo una catechina e questa si lega alla proteina, diminuisce la fluorescenza). Soia ed estratto di pisello (leguminose) hanno una maggior capacità di legare l'estratto di polifenoli. Devo scegliere delle proteine che eliminino i polifenoli responsabili della torbidità, danneggiando il meno possibile i polifenoli che danno l'aroma al vino (i 2 che funzionano meglio sono soia e pisello). Normalmente vengono usate le proteine del pisello per due motivi: la soia è transgenica e la soia è un allergene. Nella chiarifica vengono aggiunte, utilizzate e poi allontanate, quindi al massimo nel prodotto può essere presente qualche traccia di proteine.

Utilizzo degli enzimi per diagnostica alimentare

Enzimi come analisi di processi

Si va a misurare la concentrazione dell'enzima e quindi la sua attività. Con queste analisi determino quanto un enzima è funzionale/efficiente e si tratta di misure cinetiche, espresse in moli di prodotto generato o consumato nel tempo per quantità. I metodi di misura possono essere a tempi prefissati o in continuo. L'analisi di processi può avere due aspetti:

• Analitico: Misurando l'attività enzimatica mi rendo conto se un trattamento è stato efficace o meno.
• Predittivo: Costruisco un modello conoscendo un determinato valore (es. la velocità dell'enzima in determinate condizioni) e poi costruisco le condizioni ottimali che mi interessano. In entrambe le situazioni misuro la velocità di una reazione.

Saggi enzimatici

• Spettrofotometrici: Misuro la formazione di un prodotto o la scomparsa di substrato attraverso una misura di assorbanza.
• Fluorimetrici: Misuro la formazione di un prodotto o la scomparsa di substrato.