Riassunti Nanomedicine

Nanomedicine

Nanotecnologie iniettabili

La nanomedicina è un campo multidisciplinare che coinvolge diversi aspetti di fisica, chimica, biologia, clinica e ingegneria. Con nano invece ci si riferisce a un materiale con dimensioni inferiori a 100 nm (=1 micron), quindi della scala dei virus.

Le nanotecnologie in medicina trovano diverse applicazioni:

• Diagnostica: utilizzo di nano-traccianti, che possono essere radioattivi o fluorescenti, per la localizzazione di tumori.
• Drug delivery: i tumori sono generalmente trattati con la chemioterapia che non è molto selettiva e ha forti effetti collaterali; con le nanotecnologie invece è possibile usare dei nanocarrier per incapsulare questi farmaci tossici e rilasciarli solo dove si trova il tumore.
• Gene delivery: introdurre frammenti di DNA e RNA nelle cellule cancerogene per curarle. C'è un problema di instabilità che richiede un incapsulamento.
• Vaccini: i vaccini permettono al nostro sistema immunitario di imparare come combattere le malattie e come riconoscere i corpi estranei. I nanomateriali possono essere usati come trigger in questo processo.
• Ingegneria dei tessuti: ad esempio utilizzo di idrogeli (viscoelastici) per aumentare la proliferazione delle cellule nervose per la rigenerazione dei nervi.

Tipologie di nanoparticelle

È possibile identificare 5 tipologie di nanoparticelle:

• Liposomi: sono formati da una membrana composta da un bilayer di fosfolipidi, in modo da creare un nucleo idrofilico in cui possono essere caricati i farmaci; hanno il vantaggio di non scatenare una risposta immunitaria.
• Coniugato polimero-farmaco: collegando una molecola di farmaco a un polimero, che funge da vettore e deve essere compatibile e biodegradabile.
• Nanoparticelle polimeriche: sono composte da un nucleo idrofobico che contiene farmaci e una membrana idrofilica a contatto con l'ambiente extracellulare.
• Dendrimeri: presentano diversi rami e sono più complicate dal punto di vista della sintesi ma permettono di controllare le nanoparticelle trasportate, grazie ai diversi domini.
• Nanoparticelle di ossido di ferro: fanno parte delle nanoparticelle inorganiche e sfruttano le proprietà magnetiche del ferro per essere usati con contrasto durante una MRI per la rilevazione dei tumori; recentemente sono state tolte dal mercato perché non si degradano facilmente quindi il rischio è di avere danni causati dal loro accumulo.

Strategie per l'utilizzo di nanoparticelle nel trattamento del tumore

Targeting passivo: dovuto all'effetto EPR (Enhance Permeability and Retention). I tumori crescono molto velocemente e sono caratterizzati da una struttura disorganizzata in cui i nuovi vasi vascolari, formati a causa della crescita del tumore, presentano dei buchi (fenestrae). Se le nanoparticelle sono abbastanza piccole possono passare attraverso questi fori e non tornare al vaso per diffusione perché il sistema linfatico non funziona nei tumori. Il risultato è quindi l'accumulo di nanoparticelle in modo passivo.

• La dimensione di queste nanoparticelle è molto importante: se sono troppo grandi non si accumulano nei tumori ma in altri organi altamente vascolarizzati come polmoni, fegato, reni e milza, ma se sono troppo piccole attraversano la barriera di filtrazione glomerulare dei reni e vengono espulse. Quindi le dimensioni devono essere comprese tra i 10 nm e i 100-200 nm.

Targeting attivo: si basa sul riconoscimento del ligando-recettore. In questo caso è possibile fare un coating sulla nanoparticella con polimeri che hanno gruppi funzionali che si legano alle proteine esposte dalle cellule cancerose. Il metodo risulta poco selettivo perché alcuni recettori possono essere espressi anche da cellule sane e presenta la grossa limitazione che le nanoparticelle con questi ligandi sono riconosciute come corpi estranei dal sistema immunitario.

• Incapsulare queste particelle e studiare il rilascio dal momento che il profilo di concentrazione nel tempo di un farmaco deve idealmente rimanere tra la minima concentrazione necessaria per avere un effetto e il valore massimo che permette di non avere effetti tossici. Questo è ottenibile tramite iniezioni multiple, nanoparticelle con il farmaco (spesso idrofobico) nel core oppure tramite idrogeli smart (sensibili a T o pH).

Opsonizzazione

Con opsonizzazione si intende il processo per cui un organismo estraneo si ricopre di opsonine (componente del siero del sangue che aiuta nel processo di riconoscimento fagocitario), rendendo il materiale più visibile alle cellule fagocitarie. L’opsonina si lega in modo non specifico ovvero senza l’uso di anticorpi ma per interazione elettrostatica o idrofobica.

Nel caso delle nanoparticelle, questo processo è realizzato dal sistema reticoloendoteliale (RES), anche noto come sistema fagocitario mononucleare (MPS), ovvero una parte del sistema immunitario in cui possiamo individuare cellule reticolari (situate in polmoni, linfonodi, milza e midollo osseo), macrofagi e cellule di Kupffer (situate nel fegato). Quando la nanoparticella si trova in questi organi, per risultare invisibile al sistema immunitario, deve essere rivestita di un polimero che eviti l'assorbimento delle proteine come il PEG (si crea un rivestimento d’acqua attorno al PEG). Ci sono altri svantaggi nell'uso eccessivo del PEG come la generazione di anticorpi PEG e il fatto che non sia biodegradabile quindi è necessario usare catene corte che possano attraversare le barriere dei reni.

Un metodo alternativo al rivestimento in PEG è il targeting attivo ovvero mettere i ligandi degli anticorpi sulle nanoparticelle in modo che non siano riconosciuti dal sistema immunitario. Dal momento che gli anticorpi sono piuttosto grandi, è necessario utilizzare un enzima che rompe i legami (è possibile rompere i legami disolfuro) e ottenere parti più piccole oppure sintetizzare un peptide sintattico (10 AAs) che può anche legare il bersaglio, o legare sequenze di RNA e DNA dell’anticorpo.

Strategie per il drug delivery

• Agenti di superficie convenzionali: sono piccole molecole con una coda idrofobica e una testa idrofilica che, appena vengono messe in acqua, sono in grado di auto-assemblarsi con le teste orientate all'esterno e le code orientate nel nucleo, che potrebbe essere usato per incapsulare un farmaco idrofobico. Vengono usati per sintetizzare le micelle.
  • Come agenti di superficie possono essere utilizzati anche copolimeri composti ad esempio da PEG (testa) + PLA/PGA/PLGA/PCL (coda).
  • Preparazione delle micelle: agente di superficie che si auto-assembla in acqua mentre il farmaco, che è a basso peso molecolare, rimarrà per principio auto-assemblante nel core con forze di Van der Waals che lo mantengono all'interno; è possibile anche funzionalizzare la superficie con anticorpi o peptidi e ottenere un nanocarrier.
  • Concentrazione critica delle micelle (CMC): sopra una certa concentrazione dell’agente di superficie ottengo delle micelle, sotto ottengo dei copolimeri disciolti (=unimeri). Per evitare questo problema posso progettare un'architettura più complessa a più bracci con guscio idrofilico e nucleo idrofobico, simile ad una micella ma con la differenza di essere fatta da una singola macromolecola quindi di non avere una CMC.
• Lipidi: materiali naturali con un dominio idrofobico e una testa idrofila e due catene alifatiche, di cui una contiene un doppio legame; sono agenti di superficie con cui è possibile generare micro-emulsioni, liposomi e nanoparticelle lipidiche solide (=simili a micelle ma biodegradabili), con un farmaco idrofobo nel core. È possibile, inoltre, incapsulare acidi nucleici o RNA per il gene delivery, grazie alla formazione di un aggregato detto lipoplex causato dal legame elettrostatico tra RNA – e lipidi +.
  • Preparazione di nanoparticelle lipidiche solide: si prende il lipide e si alza la T a 50°C in modo da ottenere la fusione del materiale e si mischia con acqua, formando un’emulsione; si sintonizza la loro dimensione utilizzando l'omogeneizzazione e si raffredda il tutto diminuendo la T in modo da poter preparare una nanoparticella lipidica solida con una testa idrofila in modo che rimangano ben disperse nell'acqua e siano stabili nella fase acquosa.
• Polimeri: possono essere di derivazione naturale o sintetici; provengono da una polimerizzazione di monomeri e, quando è lo stesso, si chiamano omopolimeri altrimenti si parla di copolimeri. Le proprietà chimico fisiche cambiano in base al tipo di blocchi che sono fatti. È possibile creare anche polyplex ovvero lipoplex ma con un policatione al posto del lipide.
  • Coniugato polimero-farmaco: composto da un polimero auto-assemblato con il farmaco che viene trasportato nella catena polimerica e, quando raggiunge il bersaglio, il legame chimico covalente tra farmaco e polimero può essere scisso, rilasciando il farmaco. Un’idea di struttura potrebbe essere a più bracci come i dendrimeri che sono altamente funzionali. Oltre al farmaco possono essere legati anche peptidi.
  • Doxorubicina: farmaco che viene legato tramite funzionalizzazione del gruppo OH del HPMA ovvero il monomero del PHPMA, solubile in acqua, non immunogenico e non tossico.
• Nanoparticelle inorganiche: la maggior parte di questi materiali non è biodegradabile quindi rimane nel corpo per molto tempo; un esempio è l’oro per la diagnostica, i fosfati di calcio per la rigenerazione e la silice che è non tossico.
  • Esempio di nanotubi di carbonio che possono essere funzionalizzati con anticorpi o innescare una qualche attività biologica.

Biodistribuzione

Studio del percorso delle nanoparticelle nel tempo: durante le prime 4 ore si ha un enorme accumulo nel cuore, nel fegato e qualcosa negli organi altamente vascolarizzati (polmoni, milza, reni). Dopo 72 ore, si ha la quantità preponderante fegato. Dopo 10 giorni, vediamo che abbiamo una grande quantità solo nel fegato e nei reni. Negli studi quantifichiamo la quantità di nanoparticelle negli organi e tracciamo la distribuzione nel tempo.

Il parametro chiave è la dimensione, perché se le particelle sono abbastanza piccole possono circolare nel sangue fino a raggiungere l'organo bersaglio, altrimenti vengono accumulate negli organi altamente vascolarizzati come reni e milza e la quantità che può raggiungere il tumore è trascurabile. Quindi devono essere più piccoli di 200 nm, altrimenti si accumuleranno negli organi, ma più grandi di 6-7 nm, altrimenti verranno espulsi dai reni.

Ci sono diverse tecniche per regolare la dimensione di queste particelle e caratterizzare le dimensioni:

• Microscopia elettronica: TEM (più usata) o SEM.
  • Il TEM lavora sottovuoto, quindi è necessario far evaporare il solvente (acqua) e per l'evaporazione le particelle cominceranno a depositarsi sul fondo della superficie, quindi il punto chiave è scegliere la concentrazione adeguata a ottenere immagini significative. Una volta che si ottengono immagini 2D di particelle, con un semplice software come ImageJ, si può calcolare il diametro di queste particelle e ottenere la curva di distribuzione, la dimensione media, e una curva di dispersione di questa dimensione delle particelle.
  • Se la distribuzione delle dimensioni risulta stretta, idealmente, abbiamo particelle mono-disperse, il che significa che tutte le particelle dovrebbero avere la stessa dimensione, nella nanomedicina sarebbe meraviglioso perché tutte le particelle si comportano esattamente allo stesso modo; al contrario se la distribuzione è molto grande, può accadere che una percentuale enorme di nanoparticella non raggiunga il bersaglio, quindi idealmente, la nostra distribuzione dovrebbe essere la più stretta possibile!
• Dynamic Light Scattering Technique (DLS): misura il moto browniano delle particelle ovvero il movimento casuale delle particelle dovuto all'interazione con le molecole del solvente.
  • Lo scattering dinamico è una tecnica, che con un semplice laser e un rilevatore, è in grado di misurare la luce di dispersione proveniente dall'oggetto; quindi, abbiamo particelle che vanno da tutte le parti e abbiamo il rivelatore ad un certo angolo rispetto al laser incidente disperso. La luce diffusa sarà una funzione di un vettore di dispersione 'q', e il suo modulo sarà in funzione dell'angolo del rivelatore, dell'indice di rifrazione della sospensione, e della lunghezza d'onda del raggio laser.
  • Se le particelle sono relativamente piccole la posizione della nanoparticella nel tempo varierà molto frequentemente, a causa dal moto browniano, mentre per particelle più grandi questi movimenti diventano meno frequenti. Quindi posso associare la dimensione di queste nanoparticelle alle frequenze di questo segnale. Questo può essere fatto utilizzando una funzione di correlazione. In genere invece di tracciare la funzione di correlazione si usa la sua forma su scala semilogaritmica, in modo da individuare subito le dimensioni dal momento che il grafico rappresenta il tempo di decadimento e maggiore è la dimensione maggiore è questo tempo. La pendenza del grafico è correlata alla dispersione: idealmente se le particelle sono monodisperse dovrebbe scendere quasi verticale.
  • Se la distribuzione è gaussiana, o idealmente adattabile ad una funzione gaussiana, conosciamo l'espressione della funzione gaussiana, quindi possiamo definire l’indice di polidispersità dividendo la deviazione standard per la dimensione media. Questo indice è quello che caratterizza quanto ampia o stretta la vostra distribuzione. Se il valore è tra 0 e 0,05 è molto buono per la nanomedicina, perché vuol dire che le particelle sono monodisperse. Da 0,05 a 0,07 è ancora buono ma le particelle iniziano ad essere abbastanza polidisperse, fino a valori superiori a 0,7 significa che la polidispersità è molto grande.
  • Differenza con TEM (particella essiccata): quando si misura un diametro con DLS si misura ciò che chiamiamo 'idrodinamica', il che significa che non è solo il diametro della particella, la cui forma è sferica, ma il diametro idrodinamico (DH), che comprende l'intera particella più le molecole d'acqua assorbite. Il DH può variare molto con una proteina idrofila o idrofoba. La CMC può essere facilmente misurata dal DLS attraverso diametro delle micelle e l'indice di polidispersità. Se si guarda la funzione di correlazione prima e dopo la transizione CMC, si può vedere che per c>CMC si ha la grandezza delle micelle mentre per c<CMC si ha il disassemblamento delle micelle in unimeri e le dimensioni diminuiscono notevolmente.
• Nanoparticles Tracking Analysis: si usa un microscopio (ottico) e si illumina il campione con un raggio laser. Le nanoparticelle si disperderanno e sarà possibile visualizzare la macchiolina con il microscopio (applicando anche una fotocamera digitale). La macchiolina si muoverà a causa dei movimenti browniani delle particelle. Attraverso un software è possibile misurare i movimenti delle particelle, il coefficiente di diffusione e la dimensione.
  • Differenza con DLS: attraverso la macchiolina è possibile vedere le particelle.

Diagnostica

Le nanoparticelle vengono utilizzate come tracciante per rilevare una malattia specifica. Nella maggior parte dei casi le nanoparticelle utilizzate per il rilevamento sono inorganiche piuttosto che organiche.

La tecnica della fluorescenza consiste nell’utilizzare nanoparticelle fluorescenti quindi, se illuminate con una luce ad una certa lunghezza d'onda, emettono luce ad una diversa lunghezza d'onda e questa luce può essere rilevata sia da un microscopio o da un rilevatore.

• Si vorrebbe arrivare a localizzare esattamente dove si trova il tumore ma c’è un problema di penetrazione della luce nei tessuti: più si va in basso nella lunghezza d'onda minore è la penetrazione nel tessuto e maggiore è il pericolo perché guadagna più energia, quindi c'è più possibilità di danneggiare il DNA dello strato esterno della pelle. Il massimo di penetrazione si ottiene con l’infrarosso e corrisponde a 4mm ma se un tumore nel corpo è più profondo di 4 mm, nemmeno la luce infrarossa può penetrare. Questa è una grande limitazione per la fluorescenza nella nanomedicina.

Perché abbiamo questo problema di penetrazione? Il motivo è che siamo pieni di materiale proteico (emoglobina ad esempio) che assorbe molta luce, quindi la penetrazione è molto limitata.

L’uso di particelle fluorescenti può tornare utile per l'analisi in vitro, o per lo studio del comportamento di certi tipo di cellule o esperimenti ex vivo. Per tutti queste analisi è indispensabile un microscopio a fluorescenza in cui il campione viene illuminato con una luce di lunghezza d'onda specifica, la luce di illuminazione viene separata dalla fluorescenza emessa attraverso l'uso di un filtro di emissione spettrale; questa luce viene poi riflessa da uno specchio, che è chiamato beamsplitting perché con un angolo di 45° può riflettere la luce a 90°. Quindi la luce riflessa illuminerà il campione, se il campione contiene alcuni fluorofori, il materiale è fluorescente quindi emetterà luce a diverse lunghezza d'onda. I fluorofori eccitati presenti nel campione emettono luce di lunghezze d'onda maggiori, passeranno attraverso il beamsplitter, e raggiungeranno una lente che infine trasferirà la luce all'oculare.

• Perché il fluoroforo può emettere luce quando la luce incidente eccita la molecola? Dovremmo spiegarlo usando il diagramma energetico di Jablonski: se si prende un fluoroforo (molecola con molti doppi legami o gruppi fenolici) questo permette la generazione di un composto con atomi i cui elettroni sono in uno stato...