Concetti Chiave
- La replicazione del DNA inizia in punti specifici chiamati origine di replicazione, con differenze tra batteri ed eucarioti nella loro struttura e riconoscimento.
- Le elicasi separano i filamenti di DNA formando bolle di replicazione, mentre le proteine SSB mantengono i filamenti separati e le topoisomerasi alleviano le tensioni generate durante l'apertura del DNA.
- La DNA polimerasi inizia a duplicare il filamento solo dopo che la primasi ha costruito un primer di RNA, necessario per l'attacco dei nuovi nucleotidi.
- Negli eucarioti, esistono tre tipi di DNA polimerasi, ognuna con funzioni specifiche: Pol α, Pol δ e Pol ε, che si occupano rispettivamente dell'inizio della sintesi, della correzione degli errori e della sintesi del filamento guida.
- Nei procarioti, la Pol III è la principale DNA polimerasi e duplica entrambi i filamenti simultaneamente, mentre la stabilità della polimerasi è garantita dalla pinza scorrevole PCNA.
Origine della replicazione
Per iniziare la replicazione, il DNA deve aprirsi in un punto specifico chiamato origine di replicazione (Ori).
•Nei batteri, esiste un’unica origine (oriC) con molte coppie di basi A-T, più facili da separare rispetto alle G-C. Una proteina chiamata DnaA si lega a questa sequenza e apre la doppia elica. Poi, l’elicasi DnaB, aiutata da DnaC, separa i due filamenti come una cerniera.
•Negli eucarioti, i cromosomi sono molto più grandi, quindi hanno molte origini di replicazione, ovvero sequenze ricche di A=T che sono più semplici da separare. Qui entra in gioco un complesso proteico chiamato ORC che riconosce i siti di origine. Su ogni sito di origine individuato, si aggiungono tutti i fattori di replicazione dando vita al pre-replication complex, che “prepara” il DNA per la replicazione. Ogni origine può essere utilizzata una sola volta per ciclo cellulare, per evitare di duplicare uno stesso tratto. Tale compito è affidato al licensing factor.
Ruolo delle elicasi e SSB
Quindi, intervengono le elicasi che separano i due filamenti di DNA e formano delle bolle di replicazione, alle cui estremità abbiamo forcelle di replicazione. Avendo quindi le due estremità delle forcelle di replicazione, abbiamo una duplicazione in direzioni opposte, ovvero bidirezionale.
Una volta separati i due filamenti vengono mantenuti separati dalle SSB.
Man mano che il doppio filamento viene aperto, si possono generare delle tensioni. Questa tensione è alleviata dalle topoisomerasi (nei provarioti si chiama girasi), enzimi che tagliano temporaneamente il DNA: Topoisomerasi I: taglia un singolo filamento e Topoisomerasi II: taglia entrambi i filamenti. Il filamento tagliato scarica lo stress, dopodiché il legame fosfodiesterico viene ristabilito.
Inizio della duplicazione
A questo punto, la DNA polimerasi può ricopiare il filamento, ma per funzionare, ha bisogno di un punto di partenza su cui “attaccare” i nuovi nucleotidi. Entra in gioco l’enzima primasi che costruisce un piccolo pezzo di RNA chiamato primer, dal quale la polimerasi inizia a duplicare.
Gli enzimi principali della replicazione sono le DNA polimerasi, che aggiungono nucleotidi formando legami fosfodiesterici. L’energia deriva dall’idrolisi del pirofosfato che hanno i nucleotidi stessi prima di essere attaccati.
Tipi di DNA polimerasi
Negli eucarioti abbiamo 3 tipi di DNA polimerasi:
•Pol α: è la polimerasi che inizia ad aggiungere nucleotidi vicino al primer, formando un tratto ibrido. •Pol δ: sintetizza il filamento lento fatto dei frammenti di Okazaki con attività 3’→5’ esonucleasica, ovvero ripercorre il filamento all’indietro cambiando i nucleotidi sbagliati. Tale attività è anche chiamata correzione di bozze o proofreading. Se l’errore sfugge a questo meccanismo interviene il meccanismo di mismatch reapir che funziona allo stesso modo.
•Pol ε: sintetizza il filamento guida (leading strand) con attività 3’→5’ esonucleasica.
Polimerasi nei procarioti
Anche nei Procarioti abbiamo 3 tipi di DNA polimerasi:
•Pol III: da DNA polimerasi principale che sintetizza i filamenti. È unica sia per il filamento guida che per quello tardivo poiché duplica entrambi contemporaneamente, tramite la formazione di un’ansia sul filamento tardivo in modo che orienta anche quello tardivo nella stessa direzione del filamento guida.
•Pol I: rimuove primer RNA e sostituisce con DNA.
•Pol II: coinvolta solo nella riparazione del DNA.
Stabilità delle polimerasi
Negli eucarioti le polimerasi tendono a staccarsi dal filamento, per interviene la pinza scorrevole PCNA, caricata da RFC, che mantiene la polimerasi stabile sul DNA.
Domande da interrogazione
- Qual è il ruolo dell'origine di replicazione nella duplicazione del DNA?
- Come avviene la separazione dei filamenti di DNA durante la replicazione?
- Qual è il ruolo della primasi nella duplicazione del DNA?
- Quali sono i principali tipi di DNA polimerasi negli eucarioti e le loro funzioni?
- Come viene garantita la stabilità delle polimerasi durante la replicazione nei procarioti?
L'origine di replicazione (Ori) è il punto specifico dove il DNA si apre per iniziare la replicazione. Nei batteri, esiste un'unica origine (oriC), mentre negli eucarioti ci sono molte origini, tutte riconosciute da un complesso proteico chiamato ORC, che prepara il DNA per la replicazione.
Le elicasi, come DnaB nei batteri, separano i filamenti di DNA formando bolle di replicazione. Le SSB mantengono i filamenti separati, mentre le topoisomerasi alleviano le tensioni generate durante l'apertura del DNA.
La primasi costruisce un primer di RNA che fornisce un punto di partenza per la DNA polimerasi, che inizia a duplicare il filamento di DNA aggiungendo nucleotidi.
Negli eucarioti ci sono tre tipi di DNA polimerasi: Pol α, che inizia la sintesi vicino al primer; Pol δ, che sintetizza il filamento lento e corregge errori; e Pol ε, che sintetizza il filamento guida.
Negli eucarioti, la stabilità delle polimerasi è garantita dalla pinza scorrevole PCNA, caricata da RFC, che mantiene la polimerasi sul DNA, evitando che si stacchi durante la replicazione.
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