Concetti Chiave
- La PCR è una tecnica di laboratorio per amplificare rapidamente un tratto di DNA, replicando il processo di duplicazione del DNA in provetta attraverso cicli di temperatura.
- I componenti essenziali per la PCR includono DNA da amplificare, primer specifici, una DNA polimerasi resistente al calore e nucleotidi liberi per la sintesi.
- Il ciclo di PCR consta di tre fasi: denaturazione a 95 °C, annealing a 40-55 °C per l'appaiamento dei primer, e allungamento a 65-72 °C per la sintesi del nuovo filamento.
- La PCR ha applicazioni importanti, come la produzione di geni per studi, l'ottenimento di impronte di DNA da campioni minimi e l'individuazione precoce di infezioni virali.
- Per il SARS-CoV-2, si utilizza la RT-PCR, che prevede la retrotrascrizione dell'RNA virale in cDNA, seguita dall'amplificazione e quantificazione tramite fluorescenza.
La reazione polimerasica a catena (o PCR) è una tecnica di laboratorio che consente di produrre rapidamente un elevato numero di copie di un tratto di DNA (amplificare), di cui sia nota, almeno in parte, la sequenza nucleotidica. La metodica replica in provetta la duplicazione del DNA e la ripete ciclicamente.
per cui sono necessari:
- il DNA da amplificare;
- due primer complementari ai due filamenti di DNA, grazie ai quali la polimerasi può iniziare a sintetizzare i nuovi filamenti;
- una DNA polimerasi resistente alle alte temperature (Taq polimerasi, proveniente dal batterio termofilo Thermus aquaticus);
- nucleotidi liberi, utilizzati per la formazione dei filamenti di DNA di nuova sintesi.
I primer sono brevi sequenze di DNA composte da circa 20 nucleotidi: sono a singolo filamento e vengono progettati specificatamente in modo da potersi appaiare al tratto di DNA da amplificare.
Fasi del ciclo PCR
Il tutto viene posto in un termociclatore, uno strumento in grado di variare la temperatura per vari cicli di tempo precedentemente impostati al computer. Ogni ciclo di PCR consiste di 3 fasi:
- denaturazione: il campione viene scaldato a 95 °C per rompere i legami a idrogeno tra le basi azotate
del DNA;
- annealing: la temperatura viene abbassata a 40 - 55 °C per consentire ai primer di appaiarsi al DNA;
- allungamento: la temperatura viene alzata a 65 - 72 °C per permettere alla Taq polimerasi di sintetizzare il nuovo filamento.
Il processo viene ripetuto per 30 - 40 cicli circa.
Applicazioni della PCR
Si ricordano tre applicazioni della PCR particolarmente rilevanti:
1. consente di produrre una quantità apprezzabile di un certo gene che deve essere studiato;
2. permette di ottenere l'"'impronta di DNA" (DNA fingerprint) di una persona lavorando su campioni piccolissimi, come un capello o una traccia di tessuto che contenga anche una cellula sola (la si usa, quindi, specie nella medicina forense). Ciò è possibile perché il genoma di ogni individuo è caratterizzato da una sequenza nucleotidica diversa da quello di ogni altro. In particolare, esistono regioni del DNA che sono estremamente variabili da un individuo all'altro: utilizzando inneschi specifici per queste regioni, e partendo da un campione anche piccolissimo, la PCR può amplificarne rapidamente il DNA e permettere di stabilire con certezza a chi appartiene il campione stesso;
3. è utilizzata per individuare infezioni virali in una fase precocissima: scegliendo come inneschi delle sequenze complementari al genoma virale e utilizzando la PCR su di un campione di sangue, si riesce ad amplificare e quindi individuare il genoma virale anche quando sia presente in un'unica copia.
PCR e SARS-CoV-2
Uno dei metodi utilizzati in laboratorio per determinare la positività al SARS-CoV-2 consiste nel cosiddetto tampone molecolare: dal materiale biologico prelevato dalle prime vie aeree del soggetto viene estratto l'eventuale RNA virale, questo viene amplificato con una PCR particolare, la RT-PCR.
Questa tecnica è del tutto identica alla classica PCR con l'aggiunta di una fase iniziale di retrotrascrizione (da cui il nome: Reverse Transcriptase-PCR): 'RNA del virus viene retrotrascritto in cDNA, il quale viene poi amplificato con la PCR. La quantità di DNA ottenuto è quantificabile grazie a molecole fluorescenti che legano il DNA. La presenza della fluorescenza sarà proporzionale alla quantità di DNA prodotta e quindi alla presenza iniziale del virus: nel caso di un soggetto negativo, in cui il virus non è presente, la fluorescenza sarebbe pari a zero.
Domande da interrogazione
- Che cos'è la reazione polimerasica a catena (PCR) e come funziona?
- Quali sono i componenti necessari per eseguire una PCR?
- Quali sono le fasi del ciclo PCR?
- Quali sono alcune applicazioni pratiche della PCR?
- Come viene utilizzata la PCR per il SARS-CoV-2?
La PCR è una tecnica di laboratorio che permette di amplificare rapidamente un tratto di DNA, replicando in provetta il processo di duplicazione del DNA attraverso cicli di denaturazione, annealing e allungamento.
Per eseguire una PCR sono necessari il DNA da amplificare, due primer complementari, una DNA polimerasi resistente alle alte temperature (come la Taq polimerasi) e nucleotidi liberi.
Ogni ciclo PCR comprende tre fasi: denaturazione (scaldare a 95 °C), annealing (abbassare a 40-55 °C per l'appaiamento dei primer) e allungamento (alzare a 65-72 °C per la sintesi del nuovo filamento).
La PCR è utilizzata per produrre quantità significative di geni per studi, ottenere impronte di DNA da campioni minimi e individuare infezioni virali in fase precoce, amplificando il genoma virale.
Per il SARS-CoV-2, si utilizza la RT-PCR, che include una fase di retrotrascrizione dell'RNA virale in cDNA, seguito dall'amplificazione. La fluorescenza prodotta è proporzionale alla quantità di DNA e quindi alla presenza del virus.
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