Riassunto Patologia clinica

Biologia della salute

Test genetici

I test genetici consistono nell'analisi di geni (RNA, DNA, cromosomi, ecc.) o del loro prodotto/funzione al fine di individuare o escludere mutazioni associate a patologie. Riguardano non soltanto il singolo individuo che si sottopone al test ma tutta la linea biologica. Questi test rientrano fondamentalmente in quattro categorie: diagnosi sintomatica o presintomatica, test di suscettibilità, test prenatali (per patologie ereditarie) e test farmacogenetici.

Interessando un’intera linea biologica, possiamo trovare due diversi approcci con cui si trattano i dati degli interessati: approccio eccezionalistico (i dati genetici sono considerati patrimonio intimo dell’individuo e fortemente discriminanti, proprio per questa peculiarità vengono adottate alcune accortezze, come consulenza genetica e pseudoanonimizzazione dei dati) oppure inclusivistico (i test genetici sono considerati come tutti gli altri test, è solo previsto un consenso informato per procedere nessun’altra accortezza).

Macrogruppi di test

• Molecolari → Test con approcci tradizionali, permettono la diagnosi della maggior parte delle malattie biochimiche ereditarie o per lo meno delle più frequenti.
• Noi ci concentreremo sui test molecolari. Perché un individuo sia significativo nei test genetici deve essere eterozigote. I marcatori che sono stati selezionati sono locus altamente polimorfici, ovvero sono presenti nella popolazione degli alleli con una frequenza maggiore a 1% (siccome esistono questi alleli in forme diversi, perché appunto sono polimorfici, se la frequenza è < 1% allora si parla di varianti rare).

I marcatori che utilizziamo più frequentemente sono i microsatelliti o VNTR: vado a vedere quante volte i 2/3 nt si ripetono (il numero di ripetizioni di questi di- e trinucleotidi rappresenta i diversi polimorfismi). Per riconoscerli e valutarne la lunghezza mi basta amplificare con PCR e fare elettroforesi.

In alternativa si possono usare gli SNP che sono ripetizioni a singolo nucleotide. Questi sono più frequenti lungo il genoma (1 ogni 1kb VS 1 ogni 10kb dei VNTR) ma hanno il difetto di essere più raramente in eterozigosi; studiando però più SNP in associazione tra loro possono trovare degli aplotipi in eterozigosi nella popolazione (più utili). Hanno il vantaggio di essere automatizzabili o posso lavorare su grandi numeri grazie alle tecniche di sequenziamento o di mutation scanning.

Test genetici indiretti

Vado a ricercare un marcatore che so segregare insieme al gene malattia nella famiglia in esame (sono analisi di linkage, ormai in disuso per lo sviluppo di test diretti). Utilizzo i marcatori (VNTR o SNP) sopra indicati. Ho alcuni limiti:

• Questo tipo di test non può essere applicato a singoli individui, anzi mi servono famiglie quanto più ampie possibili e se mi mancano gli aplotipi di alcuni elementi chiave posso non cavarci un ragno dal buco.
• C'è il problema della ricombinazione genica: tendenzialmente però, più due locus sono vicini (polimorfismo e mutazione) e meno sarà probabile che avvenga ricombinazione ma mai dire mai (1 cM di distanza genica significa che c’è 1 evento di ricombinazione su 100 meiosi).
• Un altro grosso problema è quello dell'eterogeneità genetica, che consiste nel fatto che mutazioni a livello di loci diversi possono avere lo stesso effetto fenotipico (esempio Alzheimer: può essere dovuta a mutazioni nel gene presenilina1 oppure nel gene dell’APP).

Un esempio di applicazione riguarda la ricerca della mutazione del gene APDK nel rene policistico autosomico dominante (malattia autosomica dominante): per ricercare la presenza o meno della mutazione so che vicino al gene APDK sul cromosoma 16 c’è un VNTR in linkage con la mutazione; tuttavia però la mutazione può anche essere sul cromosoma 4 e determinare lo stesso fenotipo patologico.

Anche se questo genere di test sta venendo soppiantato da quelli diretti, c’è un’applicazione ancora utilizzata che è quella del parental exclusion testing (per la malattia di Huntington). È una malattia autosomica dominante ad insorgenza tardiva caratterizzata da demenza progressiva (determinata da amplificazione di triplette per la glutammina che quando superano una certa soglia causano la produzione di proteine tossiche per il SNC che si accumulano; il gene interessato è quello dell’huntingtonina sul cromosoma 4).

Test genetici diretti

Vado a ricercare direttamente le mutazioni responsabili (non singolarmente ma tutte insieme) dell’insorgenza della malattia che sto diagnosticando. Distinguiamo due diversi approcci:

• Ricerca di mutazioni note: sono mutazioni che mi aspetto di trovare in un individuo malato (esempio: mutazioni del fattore V di Leiden associati alla trombofilia, predispongono ad eventi trombotici).
• Ricerca di mutazioni non note: non lo so a priori ma se le trovassi in un paziente malato potrei accorgermi che causano la patologia (conosco il gene ma non so quale mutazione sia la causa della malattia).

Tecniche per la ricerca delle mutazioni note

• Se devo ricercare amplificazioni o delezioni di regioni cromosomiche posso procedere con PCR + elettroforesi.
• Se devo ricercare mutazioni puntiformi ho tre diverse tecniche da poter applicare:
  • ARMS (amplification refractory mutation system)
  • RDB (reverse dot blot)
  • MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification)

ARMS

È una tecnica PCR che prevede l’impiego di primers disegnati in modo tale che si ottenga un prodotto dell’amplificazione a seconda che io abbia la sequenza wt o mutata. In pratica, metto un nucleotide determinante (è l’appaiamento o meno, quindi l’identificazione) all’estremità 3’ del primer (dove la Taq polimerasi aggiunge nucleotidi, quindi se l’ultimo nt non appaia perfettamente (quindi al 3’ del primer) la polimerasi che deve ripartire da lì fa fatica e non amplifica. In alternativa, metto anche un mismatch nella penultima base: se la sequenza giusta avremo un solo mismatch nella penultima base del primer e quindi la polimerasi con un calcio in culo parte e dà l’amplificato; se invece c’è quella sbagliata allora in totale ne avremo due (il mio mismatch che ho messo apposta e quello non complementare) ed è meno probabile che la Taq avanzi con l’amplificazione. Quindi, se ottengo un amplificato so che c’è la sequenza wt altrimenti c’è una base mutata.

RDB

Amplifico il mio DNA campione con una miscela di primers (modificati con biotina o fluorescina; oppure amplifico con nt modificati), in particolare vado ad amplificare quelle sequenze dove so che possono cadere le mutazioni. Nel momento in cui il DNA viene amplificato (faccio una multiplex PCR), vengono incorporati o i primers o con i nt modificati dei segnali che ci permetteranno la rilevazione. Denaturo il DNA e lo pongo su strisce di nitrocellulosa o nylon su cui troviamo bloccate le nostre sonde specifiche per sequenze normali o wt; avremo ibridazione perfetta complementarietà (visualizzo l’avvenuta ibridazione grazie ai marcatori che ho aggiunto). Esempio: test fibrosi cistica con strip per 19 mut, altra da 17 e ci sono anche altre 4/5 mut che sono regionali; in questo modo, con queste strip so anche in che punti sono avvenute le mutazioni.

MLPA

Si basa sull’ibridazione di sonde sulla sequenza di interesse: la reazione è mediata dalla DNA ligasi e pertanto c’è un’elevata specificità di accoppiamento. Disegno coppie di primer che sono specifiche o per la wt o per la sequenza mutata e le faccio appaiare. Avvenuta la ligazione, ottengo un frammento di DNA unico (sarà legato covalentemente) che verrà poi amplificato usando primer (sono gli stessi per entrambe le sequenze, alle estremità della sonda si trovano le sequenze complementari proprio a questi primer). Riconosco la sequenza mutata sulla base del peso molecolare del frammento ottenuto. Infatti, in fase di costruzione, alla sonda (per esempio) specifica per la sequenza mutata aggiungo uno spaziatore che farà sì che l’amplificato della sequenza mutata abbiamo peso molecolare diverso; faccio poi elettroforesi capillare. Ogni reazione può ricercare 50-100 reazioni.

Tecniche per la ricerca di mutazioni non note

Appartengono tutte alla categoria dei test diretti. Le tecniche di NGS hanno facilitato tutto ma si continua a preferire approcci che si avvicinano al sequenziamento classico precedute dal mutation scanning: seleziono dei frammenti di DNA e li metto a confronto con uno che reputo wt. In questo modo posso identificare in maniera rapida e grossolana la presenza di mutazioni o differenze tra i due (non per forza queste mutazioni sono patologiche, magari sono solo polimorfismi, però intanto faccio una prima scrematura). Ricordiamo che una mutazione non nota è per definizione una mutazione poco frequente. Due sono le tecniche utilizzate:

• DHPLC (denaturant high performance liquid chromatography)
• HRM (high resolution melting)

DHPLC

Applico tecniche cromatografiche liquide su prodotto di PCR. La fase fissa presente nella colonna cromatografica è idrofobica (trattiene sostanze apolari o meno polarizzate) mentre quella mobile è formata da acetonitrile (solvente). Il tutto è realizzato in condizioni di quasi denaturazione, in cui il frammento amplificato PCR è quasi del tutto denaturato. Se nel prodotto PCR sono presenti degli eteroduplex, per via della presenza di un mismatch all’interno (mutazione non nota) e trovandosi in condizioni di quasi denaturazione, tenderanno a denaturarsi parzialmente, facendo sì che siano esposte delle basi (hanno una carica) che normalmente sarebbero appaiate all’interno e in questo modo sono eluite prima. Quindi, se nell’amplificato c’è una mutazione, noi vedremo l’eteroduplex venire eluito prima (quindi ottengo due picchi: uno prima che è quello dell’eteroduplex e uno dopo che è quello dell’omoduplex). Poi sequenzio il frammento.

In questo modo, però, perderemmo tutte quelle mutazioni non note in omozigosi. Per far sì che creino ugualmente eteroduplex pure loro, mescolo il prodotto di amplificazione del soggetto in esame con il prodotto di amplificazione di un soggetto sicuramente wt, lo denaturo e successivamente rinaturo: in presenza di mutazione ottengo inevitabilmente anche degli eteroduplex.

HRM

Questa tecnica misura la fluorescenza di un amplificato quando questo viene colorato con coloranti per dsDNA (SYBR green o EVA green); l’accoppiamento fluorescenza-quantità di amplificato avviene o tramite metodi diretti (coloranti) o tramite le sonde (sonde di idrolisi o TaqMan). Quello che ottengo è una melting curve: il prodotto viene riscaldato fino a che non si arriva alla T di melting, a quel punto la fluorescenza diminuisce bruscamente. Si sfrutta lo stesso principio della RT-PCR solo che uso dei coloranti saturanti ed effettuo denaturazione rapida e rinaturazione prima di fare la curva in modo che si formano gli eteroduplex (così mi accerto che qualsiasi mutazione vi sia, se già in eterozigosi o in omozigosi, sia in un eteroduplex). Se ci sono frammenti con mismatch (eteroduplex) avremo una curva di melting diversa, si denatureranno a T più basse. Quando si arriva alla temperatura di Melting si ha un aumento brusco della velocità di cambiamento della fluorescenza e poi di nuovo, una riduzione; se c’è eteroduplex avrò due picchi.

Le tecniche NGS non necessitano del mutation scanning ma sono molto costose (se risparmio, prendo degli strumenti piccoli che però hanno capacità di analisi limitata). Per ottimizzare i costi riduco la scala d’analisi, infatti esistono sistemi che permettono di arricchire e sequenziare solo l’esoma (riduco del 90% la quantità di reads necessarie).

Esistono tecniche che permettono di ibridare sequenze specifiche e poi amplificarle. I tre livelli di arricchimento a livello diagnostico prevedono:

• Esoma
• Esoma clinico o diagnostico (sequenze trascritte dai 4800 geni che hanno un ruolo nelle malattie)
• Pannelli genici specifici di date malattie

Identificare una mutazione non basta per risalire alla malattia, bisogna valutarle tutte nel loro insieme e valutare l’intero quadro clinico. In diagnostica si preferisce ricercare mutazioni note.

Con il Circos plot mostro l’intero genoma e le porzioni in cui sono posizionate le varie mutazioni (approccio utile anche in caso di tumori, ci permette di confrontare il genoma del paziente con quello di un individuo sano). Le mutazioni che spingono la cellula verso un’evoluzione neoplastica si chiamano “driver”. Se in una cellula che evolve in senso neoplastico già c’erano delle mutazioni, queste sono trasportate durante il processo di trasformazione e sono chiamate “passeggero”.

Medicina di precisione

Con la medicina di precisione vado a concentrarmi sulle specifiche mutazioni driver che si sviluppano in quel dato paziente. Questo approccio riconosce l’importanza di queste mutazioni, inibendole si sa che ci sarà un effetto negativo sulla crescita del tumore che può portare addirittura ad una sua regressione.

Nel tumore al polmone c’è un spettro di mutazioni presenti e note (risiedono in pathway molecolari in cui posso intervenire) e su alcune di queste posso intervenire farmacologicamente. Il problema è che con questo trattamento poi subentrano mutazioni resistenti.

I farmaci utilizzati possono legare Ab, altri legano le tasche catalitiche degli enzimi e altri invece agiscono a livello del nucleo e funzionano da fattori di trascrizione.

Questo approccio della medicina di precisione prevede però una caratterizzazione molecolare del tumore tramite sequenziamento massivo. Poi elaboro i dati e una terapia e poi somministro il trattamento; devo continuare a monitorare la risposta al trattamento per assicurarmi che non insorgano resistenze.

Marcatori tumorali

Sono segnali di tipo biochimico la cui presenza o quantità può essere posta in relazione con la presenza di neoplasia; si possono trovare nei fluidi biologici oppure nelle cellule/tessuti umani in soggetti affetti da tumore. Distinguiamo:

• Marcatori tumorali presenti nei fluidi o umorali che possono essere prodotti dalla neoplasia oppure dall’ospite
• Marcatori tumorali espressi sulla cellula che possono essere citoplasmatici, nucleari o di superficie

Il problema è che questi marcatori magari aumentano anche per altre cause (fumo, alimentazione, età, ecc.) non per forza per tumori, è quindi difficile stabilire un cut off. Tendenzialmente i marcatori servono per conferma e li posso valutare o in maniera quantitativa e dinamica (variazioni nel tempo, tipo prima e dopo terapia) o li valuto in associazione. Questi marcatori li vado ad usare in gruppi di pazienti selezionati, ovvero in cui c’è un sospetto di rischio.

Alla diagnosi li valuto per avere un’idea di quanto è esteso il tumore poi li doso dopo l’atto terapeutico per vedere se ha avuto effetto e se il paziente risponde bene.

Lo studio dei marcatori ci servirà per identificare nei fluidi sequenze oncogeniche specifiche e Ab diretti contro oncogeni o geni oncosoppressori per la diagnosi di neoplasie occulte ma ci servirà anche per identificare le cellule tumorali circolanti e per identificare micrometastasi.

Marcatori umorali

• Marcatori prodotti dalla neoplasia:
  • Prodotti oncofetali → normalmente li troviamo in circolo durante la vita prenatale e, visto che le cellule tumorali riacquistano delle caratteristiche tipiche delle cellule embrionali, le cellule tumorali le producono. Tra questi abbiamo:
    • CEA (antigene carcino-embrionale): è un complesso di diverse glicoproteine appartenenti alla superfamiglia delle Ig (quelle coinvolte nel riconoscimento cellulare) prodotto durante le prime 6 sett di vita embrionale dalle cellule epiteliali di intestino, fegato e pancreas e regola lo sviluppo fetale. La produzione di CEA anche se minima è continua durante tutta la vita, può aumentare soprattutto nel siero dei pazienti con carcinomi del colon, della mammella, del polmone e degli organi urogenitali (i carcinomi sono i tumori maligni delle cellule epiteliali).
    • AFP (alfa1-globulina): è una proteina sintetizzata nel sacco vitellino a partire dal 4° mese dal fegato fetale, dall’8° mese la sua concentrazione sierica diminuisce rapidamente in corrispondenza ad una aumentata produzione di albumina; i valori calano fino ad assestarsi ai 20 ng/ml a partire dal primo anno di vita. Può aumentare nel siero di pazienti con epatocarcinomi, tumori germinali del testicolo e dell’ovaio, carcinomi embrionali del testicolo, teratomi e teratocarcinomi del testicolo e dell’ovaio.
  • Enzimi → li ritroviamo in circolo in caso di danno cellulare o di neoplasia...
    • NSE (enolasi neurono specifica): enzima citoplasmatico della glicolisi espresso in elevata quantità nelle cellule differenziate in senso neuronale o neuroendocrino, può aumentare nel siero dei pazienti con neuroblastoma o con carcinoma polmonare a piccole cellule.
    • PAP (fosfatasi acido prostatica): forma isoenzimatica della fosfatasi acida prodotta dalla prostata, la cui concentrazione aumenta in caso di tumore alla prostata.
    • LDH (lattico DH): enzima presente nel citoplasma di quasi tutte le cellule, quindi dove c’è danno mi aspetto che venga rilasciato LDH. È un enzima stabile che mantiene la sua attività anche in circolo. Esistono diverse isoforme, è un tetramero che può essere costituito da diverse combinazioni delle due diverse subunità.