Modulo Prof. Galliera (esame: biotecnologie nella diagnostica di laboratorio e fondamenti di statistica)

Principi di diagnostica

Patologia clinica

Biomarkers

Un biomarcatore, in generale, è un indicatore che dà delle informazioni sulle condizioni di un soggetto.

Non è necessariamente di tipo clinico.

Può essere:

• Indicatore di una patologia, quindi un marcatore diagnostico; può indicare anche la gravità.
• Indicatore dello stato di salute di un soggetto (temperatura corporea, pressione, battito cardiaco).
• Indicatore di quanto una terapia sta funzionando.

Forniscono delle informazioni di tipo non necessariamente clinico, ma anche di tipo fisiologico: danno informazioni sullo stato di salute di un soggetto.

I biomarcatori sono usati in diversi campi scientifici, possono essere applicati a diversi ambiti della medicina.

Un biomarcatore deve avere delle caratteristiche precise.

Esempi: livello di glicemia nel sangue ⇾ utilizzato per la diagnosi e il monitoraggio del diabete, quindi sia a livello diagnostico che terapeutico.

È anche un obiettivo clinico da raggiungere, il trattamento è corretto se riesce ad abbassare.

Consente di verificare la progressione e la funzionalità di una terapia.

Indagini strumentali come la risonanza magnetica, la TC e la radiografia ⇾ esempio: la risonanza magnetica può dare informazioni sulla progressione della sclerosi multipla.

Sostanze biologiche come gli enzimi che possono trovarsi nel sangue o in campioni tissutali, sono spesso ⇾ utilizzati per la diagnosi.

Cambiamenti genetici a livello del DNA ⇾

Scopi dell’utilizzo dei biomarcatori

1. Miglioramento del trattamento clinico

Vengono utilizzati per migliorare il più possibile il trattamento clinico di un paziente.

Consentono di misurare la sua condizione e la sua risposta a un trattamento, servono degli strumenti che danno delle risposte di tipo quantitativo.

Se la risposta non può essere misurata direttamente, i biomarkers possono essere una via alternativa per misurare un risultato clinico: sono degli end points surrogati ⇾

Consentono una misura indiretta, sono un’alternativa all’utilizzo di diagnosi strumentali che spesso sono invasive.

Esempio: per l’osteoporosi viene effettuata la misurazione dei marcatori di riassorbimento osseo, evita la visualizzazione dello stato del paziente mediante tecniche come la MOC (ha dei rischi e non può essere fatta total-body).

Vantaggi rispetto alla diagnosi strumentale

Vantaggi rispetto alla diagnosi strumentale dell’utilizzo di biomarker come end points surrogati:

• Possono essere in grado di fare misure più facilmente, più precocemente o più frequentemente mantenendo però un’elevata precisione.
• Sono meno invasivi e richiedono una minor quantità di campione.
• Sono meno influenzati da altri trattamenti.

La diagnosi strumentale è utile per fare la diagnosi, mentre non dà delle informazioni così sensibili per verificare la risposta a una terapia da parte di un paziente.

Vengono ricercati dei marcatori sierici che sono sensibili anche a cambiamenti minimi, sono utili per monitorare una terapia.

La terapia per il diabete viene monitorata in base al livello di glicemia del paziente.

Si verifica l’effetto della patologia (aumento di glucosio nel sangue) tramite una misura indiretta, basta un semplice esame del sangue: sono dei controlli sul paziente che possono essere fatti in periodi ravvicinati ⇾

La diagnosi strumentale dà delle informazioni sulla presenza o meno di una condizione (esempio: vedo una frattura), il paziente viene poi monitorato con esami del sangue (ricerca di marcatori di riassorbimento osseo).

Esempio: trattamento dell’infezione da HIV e manifestazione conclamata in AIDS.

È difficile valutare quanto la malattia progredisce o regredisce in seguito al trattamento, ora viene utilizzato il livello dei linfociti T CD4+ come end point surrogato.

Consente una valutazione indiretta dell’efficacia del trattamento o dello stato di remissione della patologia, è un modo quantitativo per verificare quanto la terapia è efficace.

2. Sviluppo di trattamenti individuali e medicina personalizzata

Esiste un minimo di variabilità delle risposte dei pazienti nei confronti delle terapie, conoscendo queste differenze è possibile calibrare meglio la terapia in dosaggi e tempistiche.

La ricerca di biomarker aiuta a:

• Migliorare la predizione del rischio di sviluppare una malattia.
• Capire come una malattia potrebbe progredire una volta che è stata diagnosticata.
• Capire come un individuo risponde a un trattamento.

Consentono di prendere delle decisioni più sicure ed efficaci in merito a un trattamento poiché forniscono informazioni fini e specifiche relative allo stato del paziente.

Metodo utilizzato nei trattamenti chemioterapici: prima di ogni ciclo vengono fatti degli esami del sangue, in base al livello del biomarcatore tumorale viene calibrata la terapia.

In patologie complesse nelle quali non vi è un marcatore sistemico (come la sclerosi multipla), si fa la risonanza magnetica per valutare lo stato del singolo paziente, monitorazione che avviene a intervalli più lunghi.

Nuovi biomarcatori vengono applicati nel campo della medicina personalizzata.

Consentono una caratterizzazione a 360° del singolo paziente.

Mondo degli omics

• Genomica: analisi dei cambiamenti di espressione di un gene ⇾
• Proteomica: analisi dei cambiamenti dei livelli di una proteina ⇾
• Metabolomica: analisi delle differenze di alcune molecole che giocano un ruolo fondamentale nella funzione cellulare ⇾

Array di biomarcatori a livelli diversi di produzione di una molecola: livello genetico, trascrizione, traduzione, secrezione e interazione a livello metabolico.

Consentono un’ampia visione del singolo paziente.

Non esiste un singolo gold standard, esiste un pannello di biomarcatori che completano il quadro.

Sviluppo

Il campo della ricerca oncologica è stato il primo ad adottare i biomarcatori, sono fondamentali nelle patologie multifattoriali.

I biomarcatori sono usati nei trials farmacologici fase II: verifica dell’efficacia ⇾

Nelle fasi finali dello sviluppo di un farmaco vengono usati dei biomarcatori legati alla progressione o meno della patologia, ma solo un numero limitato possono essere usati come end point clinici durante la fase III di sperimentazione (conferma dell’efficacia del farmaco).

Il livello di colesterolo totale non è tanto un indicatore del rischio cardiovascolare, è un’informazione troppo generica per correlarsi al rischio, per questo non è un buon marcatore; invece il rapporto VLDL/HLDL dà un’informazione più specifica ⇾

Prima di introdurre un nuovo biomarcatore nella clinica è necessario dimostrare che è correlato a uno stato clinico specifico del paziente.

Nonostante i trials, ci sono una minima quota di pazienti che non rispondono a una terapia e non si capisce il perché, ma è necessario trovare una spiegazione: esempio: espressione o meno di un recettore, metabolismo del paziente non permette l’azione desiderata del farmaco ⇾

È utile identificare questi pazienti utilizzando dei biomarkers.

I trial clinici per l’introduzione di nuovi farmaci sono spesso molto lunghi: dalla prima definizione della molecola, sperimentazione in vivo fino alla sperimentazione sull’uomo possono passare anche anni.

Servono delle risposte specifiche per consentire il passaggio da una fase all’altra, i biomarcatori se sono precisi consentono una velocizzazione della progressione degli studi: risposta quantitativa sulla risposta al farmaco ⇾

Richiesta al comitato etico per la sperimentazione, il numero dei pazienti da arruolare è funzione della variabilità attesa.

Più è elevata la variabilità attesa, più il numero dei pazienti sarà grande.

Ma se vi sono dei marcatori, il numero della variabilità attesa è minore, quindi il numero delle persone che parteciperanno alla sperimentazione diminuisce (più accettabile per il comitato etico).

L’utilizzo dei biomarcatori consente di caratterizzare meglio i pazienti e di studiare in modo più preciso una malattia, attesa di una risposta precisa e focalizzata.

Alcuni pazienti possono essere esclusi a causa della probabilità minore del beneficio atteso o del rischio di sviluppare effetti avversi.

Requisiti del biomarcatore

Biomarcatore deve avere una serie di requisiti:

• Punto di vista tecnico.
• Regolatorio, legislativo.
• Etico, deve essere migliore di quello utilizzato in precedenza.

Punto di vista tecnico

Deve essere accurato e quindi deve poter discriminare in modo preciso le situazioni positive dalle negative.

Deve essere sensibile, deve avere una soglia di detection più bassa possibile, è necessario discriminare rumore di fondo.

Deve essere specifico, non devono esserci falsi positivi o falsi negativi.

Deve avere un buon rapporto costo-efficacia, deve essere sostenibile dal punto di vista economico.

Deve essere di facile esecuzione dal punto di vista tecnico e strumentale, deve essere applicabile in tutti i laboratori.

I marker prognostici danno informazioni sul grado di evoluzione della malattia.

È necessario quantificare se è effettivamente e quanto in grado di dare delle informazioni sull’aggravamento della patologia.

Il superamento della soglia di una determinata misura corrisponde a un determinato rischio.

È importante quantificare la capacità predittiva del biomarcatore.

Importanza della valutazione statistica: potere predittivo positivo o negativo.

Il tutto deve essere calibrato in base alle caratteristiche del paziente.

Punto di vista regolatorio

Esistono una serie di registri (FDA, EMA) ai quali bisogna fare affidamento prima di introdurre in commercio o nella pratica clinica un farmaco o un nuovo biomarcatore.

A livello della comunità europea esistono diverse legislazioni specifiche per i diversi stati.

Validare i biomarcatori può essere un complesso complesso e costoso.

Un biomarcatore valido è una molecola o una sostanza che deve essere misurata con un test analitico valido e applicabile con delle performance stabilite: variabilità, cosa ci aspettiamo ⇾

È necessario avere un solido background scientifico (caratteristiche biologiche ideali) dal quale ricavare il cosiddetto end-point surrogato.

Misura quantitativa con un test applicabile nel modo più semplice possibile, deve essere riproducibile in modo tale da poter ridurre la variabilità e permettere un’interpretazione univoca dei risultati.

Misura indiretta ma quantitativa dello stato del paziente.

Classificazione dei biomarkers

Tipo 0: descrivono la naturale evoluzione di una patologia ⇾ sintomi classici: molto generali e poco quantitativi.

Tipo 1: indicazioni sull’efficacia o meno di una terapia ⇾ misura indiretta di come si sta evolvendo la patologia e degli effetti della terapia.

Tipo 2: end-point surrogati ⇾ aumento della specificità e precisione, sostituiscono in modo completo un parametro clinico.

Correlazione diretta con un parametro clinico.

A seconda della caratteristica sulla quale basiamo un biomarcatore, ne esistono diversi tipi:

• Basati sullo stato della patologia e la sua progressione.

Danno maggiori indicazioni.

Markers di detection ⇾ markers di prediction ⇾

Associati all’efficacia di un trattamento, mi aspetto che il paziente risponda al trattamento in un determinato modo.

Markers di diagnosi ⇾ markers di prognosi ⇾ come evolve la malattia.

• Basati sulla molecola specifica.

Come markers di DNA, RNA, proteine, enzimi, carboidrati.

• Basati su altri criteri.

Imaging, markers di patologia come livelli ormonali e metabolici.

I marker possono essere presenti in liquidi biologici e venire rilevati grazie a:

• Laboratory tests come l’ELISA e i vari -omics.
• Misurazioni dello stato fisiologico del paziente come la pressione, il ritmo cardiaco, …
• Misurazioni elettrofisiologiche come l’ECG e l’EEG.
• Esami istologici (biopsia) e citologici (pap-test).
• Imaging (PET, TC, RMN).

Variano a seconda dell’obiettivo clinico (diagnostico, di monitoraggio o prognostico).

È necessario definire un end-point clinico: come si sente il paziente, le sue funzionalità e la sopravvivenza.

I biomarcatori farmacodinamici permettono la valutazione della risposta a un farmaco.

Ad esempio i markers tumorali non sono diagnostici, ma vengono utilizzati per valutare la risposta di un paziente alla terapia.

Gli end-point surrogati sono dei biomarcatori correlati direttamente a uno stato clinico, sostituiscono gli end-point clinici.

Predicono i benefici clinici o i potenziali danni basati su evidenze epidemiologiche, patofisiologiche, terapeutiche, …

Ad esempio: in caso di osteoporosi, i marcatori di rimodellamento osseo valutati nel sangue sono strettamente correlati allo stato di densità ossea dell’intero sistema scheletrico.

Livelli di glicemia nel sangue e diabete.

Legame diretto e univoco, l’end-point surrogato è un sostituto della valutazione clinica.

Correlazione tra i biomarcatori

I marcatori farmacodinamici rappresentano un sottoinsieme di biomarcatori.

Sono sensibili al trattamento con la terapia e indicano quanto essa è efficace.

Al loro interno si trovano gli end-point surrogati.

Sono ancora più precisi perché correlano direttamente con lo stato clinico.

(Sottoinsieme dei biomarcatori e dei marcatori farmacodinamici)

End-point surrogato

Parametro clinico o di laboratorio che può essere utilizzato in trial come sostituito dell’end-point clinico del paziente.

I cambiamenti indotti da una terapia a livello di un end-point surrogato, riflettono i cambiamenti a livello dell’end-point clinico.

Esempio: riduzione della glicemia, riduzione della proliferazione neoplastica.

Un biomarker è un endpoint surrogato se è in grado di predire dei benefici o dei danni clinici basati su evidenze epidemiologiche, terapeutiche o patofisiologiche.

La relazione fra biomarker e stato clinico può essere:

• Inaffidabile.

Correlazione poco favorevole, troppo variabili e per questo non possono essere degli end-point surrogati.

PSA utilizzato per la diagnosi del carcinoma prostatico, ma non varia in risposta a una terapia, quindi non può essere utilizzato per il monitoraggio.

• Fotografia precisa della condizione clinica.

Il pieno effetto della terapia è osservabile mediante una valutazione del marker.

End-point surrogato: per ora non ne esiste solo uno così preciso, necessario analizzare un pannello di biomarcatori ⇾ diversi.

• Il trattamento farmacologico o chirurgico non è necessariamente correlato a uno stato clinico rilevabile con un biomarcatore.

La terapia ha un effetto indipendente su marker ed endpoint.

Il biomarcatore è solo parzialmente un end-point surrogato.

Esempio: in un paziente diabetico, la glicemia è altamente variabile, per questo si valuta ad esempio l’emoglobina glicata nel tempo.

• Nelle malattie multifattoriali o nelle patologie in cui si targetta solo un suo specifico aspetto di una patologia.

La terapia ha effetto favorevole sul marker ma non ha effetto o ha effetto sfavorevole sulla malattia o sullo stato di benessere.

Biomarker ha poco uso pratico come end-point surrogato.

Caratteristiche di un biomarcatore ideale

• Deve avere un’alta sensibilità, specificità, accuratezza e alto potere predittivo.
• Deve essere sicuro e semplice da misurare.
• Deve tenere conto delle diverse caratteristiche del paziente.
• Deve essere modificabile con il trattamento.
• Deve avere un buon rapporto costo-beneficio.
• Deve essere consistente per le varie etnie e sessi.

Utilizzi dei biomarkers

I biomarkers possono essere utilizzati nei trials clinici e quindi per lo sviluppo di nuovi farmaci ⇾ per test di screening ⇾

Deve permettere di discriminare tra lo stato sano e la malattia asintomatica.

Devono consentire di dare una fotografia della situazione dell’organo/apparato.

Per fare valutazioni sul rischio ⇾ soglia tra la condizione patologia e la condizione sana, pone determinato rischio.

Per monitorare la terapia o per selezionarne una addizionale ⇾ soprattutto per effettuare diagnosi: stadio e grado di severità della patologia, ⇾ selezione della terapia iniziale e monitoraggio di un’eventuale recidiva.

Una volta fatta la diagnosi basata sulla valutazione della patologia in termini di gravità e stadio, viene scelta la terapia e il trattamento.

Vengono utilizzati dei marcatori a macropannelli come gli omics.

Classi di biomarker utilizzati in trials

Si basano su due caratteristiche:

• Sicurezza.

Safety biomarker.

Deve essere sicuro, è necessario che non sia tossico per il paziente (deve essere biocompatibile).

Deve essere valutata la tossicità:

• A livello renale ⇾ creatinina ematica, azoto ureico.
• A livello epatico.
• A livello ematologico ⇾ emocromo citometrico.
• A livello di sicurezza ossea: calcio sierico e livelli di fosfato inorganico.

Alcuni farmaci vanno a indebolire il tessuto osseo, rischio accettabile di fronte a potenziale grande beneficio ⇾ valutazione della sicurezza a livello del metabolismo.

Glucosio nel sangue, trigliceridi, colesterolo totale, LDL, HDL ⇾ altri biomarcatori di sicurezza.

Livelli di immunoglobuline sieriche, di proteina C reattiva, fibrinogeno.

TSH, tiroxina, testosterone, insulina.

Lattato de-idrogenasi LDH, creatinin-chinasi CK, troponina cardiaca.

• Efficacia.

Efficacy biomarker.

Danno indicazioni sullo stato clinico del paziente e permettono valutazioni sull’efficacia del trattamento.

Sono quantitativi.

Quanto più la variazione è alta, tanto più il biomarcatore è sensibile nel dare informazioni sull’efficacia del trattamento.

Usati per dimostrare un cambiamento dello stato clinico di un paziente in una buona percentuale dei soggetti.

A seconda dell’obiettivo, i biomarcatori di efficacia possono essere:

Farmacodinamici ⇾ valutano la funzionalità di un farmaco.

Predittivi ⇾ stratifica la popolazione dei pazienti in responder e non-responder per un determinato trattamento.

Selezione solo dei teorici responder, pazienti che avrebbero benefici.