Patologia clinica

Patologia clinica lezione 1 prof. Oriente 08/04/2021

Introduzione alla medicina di laboratorio: fase preanalitica, analitica e postanalitica

La medicina di laboratorio comprende diverse grandi aree:

• Ematologia: prevede lo studio degli elementi corpuscolari del sangue e dei fattori della coagulazione;
• Biochimica clinica: prevede la misura di oltre 200 sostanze diverse (analiti) nei liquidi organici;
• Banche del sangue e medicina trasfusionale;
• Microbiologia clinica (diagnostica batteriologica, micologica, virologica…);
• Microscopia medica (esame delle urine…);
• Radioimmunologia (dosaggi in campo endocrinologico…);
• Immunologia (immunocitochimica, immunoistochimica, immunità cellulare…).

Il laboratorio ha il compito di assistere il medico:

• Nella scoperta della malattia o della predisposizione ad essa (es: neoplasia prostatica o diabete familiarità)
• Nella conferma dell’ipotesi diagnostica (es epatite acuta)
• Nella scelta e nel monitoraggio della terapia (es concentrati diversi di fattori in base ai test, ciclosporina, terapia anticoagulante orale)
• Nella definizione della prognosi.

Nella medicina moderna oltre l’80% dell’informazioni sono prodotte nei laboratori d’analisi.

Il laboratorio d’analisi fornisce, quindi, attraverso l’esame di campioni biologici, informazioni clinicamente utili per ridurre il margine di incertezza delle decisioni che possono essere prese in relazione a quesiti diagnostici, prognostici o di sorveglianza correlati allo stato di salute.

L’indagine di laboratorio ha lo scopo di coadiuvare il medico clinico nella diagnosi di una determinata patologia e deve coinvolgere tutto il personale: medici, infermieri, laboratorista.

Tutto il personale deve sempre mettere a disposizione le proprie conoscenze scientifiche e tecnologiche al letto del malato, negli ambulatori ed a domicilio oltre a saper dare una giusta interpretazione ai dati ottenuti.

Fasi dell’indagine di laboratorio

L’indagine di laboratorio comprende 3 fasi:

• Preanalitica
• Analitica
• Postanalitica

Fase preanalitica

Rappresenta un momento cruciale nell’ambito del processo di laboratorio, durante la quale si compie il 45% degli errori e rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate al processo:

1. Controllo della richiesta
2. Preparazione del paziente
3. Raccolta del campione
4. Trasporto del campione

1° controllo della richiesta

• Identificazione: dati demografici personali (anagrafica, data ricovero, medico curante…) Dati relativi al prelievo (tipologia del campione, giorno e ora del prelievo….)
• Motivazione della richiesta (ipotesi diagnostica, diagnosi d’ingresso, dubbi da dirimere) – moduli
• Condizioni del paziente = distanza ultimo pasto, trasfusione, terapie generali ..ora di assunzione
• Prestazione richiesta = tariffario regionale

2° preparazione del paziente

Il medico che prescrive le analisi al paziente ha un ruolo importante per il risultato finale dell’indagine 1

Patologia clinica lezione 1 prof. Oriente 08/04/2021 stessa. Le informazioni trasmesse ai pazienti garantiscono una maggiore attendibilità ed affidabilità per la fase analitica vera e propria.

3° raccolta del campione

I materiali biologici sui quali sono effettuati esami di laboratorio sono i seguenti:

• Sangue intero, plasma o siero che possono essere ottenuti da vene, arterie o capillari (prelievo)
• Urine (raccolta diretta da parte del paziente)
• Feci (raccolta diretta da parte del paziente)
• Liquido cerebro-spinale (rachicentesi)
• Liquido peritoneale (paracentesi)
• Liquido pleurico (toracentesi)
• Liquido pericardico (pericardiocentesi)
• Liquido sinoviale (artrocentesi)
• Liquido amniotico (amniocentesi)
• Liquido seminale
• Latte materno
• Saliva (raccolta diretta da parte del paziente)
• Sudore
• Capelli
• Tessuti solidi (biopsia)
• Midollo osseo (prelievo o biopsia midollare)
• Secreto bronchiale (Aspirato/Lavaggio tracheo-bronchiale o bronco alveolare)
• Succo gastrico
• Secreti: faringeo, nasale, auricolare, uretrale, vaginale, da ferita, da drenaggi.

Prelievo di sangue

Materiale

• Guanti
• Garze, cotone
• Disinfettante
• Laccio emostatico
• Sistema vacutainer
• Cerotto
• Provette

Pulire la zona dove effettuare il prelievo in modo da eliminare lo sporco e riduzione del numero di batteri patogeni in fase vegetativa

1. Lavarsi le mani
2. Indossare i guanti
3. Applicare il laccio emostatico
4. Disinfettare
5. Inserire l’ago
6. Prelievo
7. Rimuovere il laccio e l’ago
8. Tamponare
9. Etichettare le provette ed inviarle in laboratorio
10. Smaltire i rifiuti e lavarsi le mani

1° Disinfettare il braccio 2° Applicare il laccio emostatico 3° Inserire l’ago 4° Aspirare 10 ml di sangue per provetta 5° Agitare la provetta 6° massimo 3 prelievi nelle prime 24 ore

Differenza tra siero e plasma

Il plasma è il liquido giallastro che rimane dopo che dal sangue sono stati tolti i globuli rossi, i globuli bianchi e le piastrine (mediante la centrifugazione). Il siero, invece, è il plasma privo di fibrinogeno (il fibrinogeno è una proteina che, trasformandosi in fibrina, provoca la coagulazione). Il siero, dunque, non contenendo tale proteina, può essere conservato senza che si coaguli, mentre il plasma, per poter essere conservato, deve essere trattato con gli anticoagulanti.

Esame delle urine

Per l’esame delle urine, il cosiddetto "standard" che comprende sia l'esame chimico fisico (ph, peso specifico, ricerca del glucosio, delle proteine, del sangue, dei chetoni, dell'urobilinogeno e bilirubina) sia l'esame microscopico del sedimento si effettua prelevando il campione al mattino in quanto le urine emesse al mattino sono più concentrate rispetto a quelle emesse nel corso della giornata. Questa caratteristica permette di ottenere maggiori informazioni dall’esame, aumentandone la sensibilità diagnostica. Esame delle urine Le urine devono essere raccolte con la tecnica del “getto intermedio”. 2

Patologia clinica lezione 1 prof. Oriente 08/04/2021 Questa precauzione riduce, soprattutto nella donna e nel bambino, la possibilità di contaminare il campione con secrezioni vaginali o prepuziali. Se in particolari condizioni (ad esempio ritenzione urinaria) il paziente non riesce ad urinare, l’urina deve essere prelevata mediante catetere (strumento medico in materiale sintetico, morbido, che, introdotto in vescica, permette il drenaggio dell’urina).

Urinocoltura (piastra di agar)

• È il più corretto approccio al paziente con potenziale infezione delle vie urinarie
• Solo con questo metodo, ad esempio, possono essere evidenziate le infezioni miste e si può valutare la sensibilità del germe all’antibiotico.

Liquor

Puntura lombare: inserzione dell'ago tra i processi spinosi di due vertebre lombari per raccogliere il liquor cerebro-spinale che riempie il canale spinale. Inviare al più presto. Al di fuori degli orari di accettazione il liquor viene accettato sempre, previa comunicazione al laboratorio

Espettorato

Al mattino a digiuno: effettuare una pulizia accurata del cavo orale, gargarismi con acqua distillata sterile

Raccogliere l'espettorato dopo un colpo di tosse. Il materiale deve provenire dalle basse vie aeree e non essere salivare.

L’esame batteriologico va effettuato entro 30 minuti dal prelievo 3

Patologia clinica lezione 1 prof. Oriente 08/04/2021 In ogni prelievo occorre sempre: evitare ogni contaminazione del campione

Altri microorganismi non responsabili della patologia possono contaminare i campioni se il prelievo non è eseguito con modalità rigorosamente asettiche e “falsare” così il risultato delle indagini microbiologiche

Utilizzare appositi contenitori

L’uso di contenitori idonei assicura la corretta esecuzione delle indagini microbiologiche e consente il corretto trasporto e manipolazione dal campione

4° invio e trasporto

Effettuare tempestivamente il trasporto dei campioni Inviare il modulo di richiesta compilato in ogni sua parte, insieme al campione biologico

Trasportare il campione nelle apposite buste di plastica a due scomparti.

Precedentemente il campione veniva inviato tramite corriere, il quale fungeva da contatto tra il medico ed il paziente. Tuttavia, spesso le condizioni in cui il campione arrivava non erano perfette, così come i tempi erano spesso dilungati. Successivamente si utilizzò la posta pneumatica. Questa fu un’innovazione in quanto accelerava notevolmente i tempi di consegna, tuttavia presentava lo svantaggio che solo una piccola quantità di campioni poteva essere inviata ed inoltre spesso essi arrivavano non integri in seguito alla rapida accelerazione e decelerazione.

Attualmente esistono dei robot automatici che tramite nastri elettronici trasportano i campioni direttamente alle stazioni di lavoro..campione sia ben sigillato: parafilm intorno al tappo in modo da evitare qualsiasi fuoriuscita o evaporazione di liquido. tappo sia costituito da materiale inerte, onde evitare che esso possa assorbire parte del contenuto (come a volte si verificava nei tappi di polistirene).

Rischi del trasporto

Campione pervenuto in contenitore non ben chiuso o danneggiato, con conseguente fuoriuscita del materiale

Materiale inviato in quantità insufficiente per la corretta esecuzione dell’indagine richiesta o non idoneo

Materiale conservato scorrettamente (troppo a lungo o a temperatura non idonea)

Fase analitica

• Fase di accettazione esecuzione dell’esame cioè registrazione del paziente, generazione etichetta codice a barre ecc
• Validazione del dato analitico

Etichettatura del campione:

• Codice a barre
• Nome del paziente prestampato
• Tipo di campione (siero, plasma o urine)
• Tipo di indagine da effettuare..

Precedentemente questo veniva fatto a penna e ciò comportava maggior tempo e maggior rischio di errore

La provetta successivamente viene mandata su una catena (una sorta di nastro) cioè una struttura dove sono legati tutti gli apparecchi che fanno indagini diverse e poi i dati sono riportati sul computer. In alcune patologie occorre fare delle diluizioni: in condizioni di una patologia dove c’è elevata produzione di HCG, si prende il campione e bisogna diluirlo 1 a 200 o 1 a 1000, prima di faceva a mano tramite una pipetta, poi si vortexana (agitava) la provetta; oggi invece dopo l’etichettatura e centrifugazione si mette sul nastro e si fa tutto in automatico.

Sul nastro ci sono vari apparecchi, tra cui un robot con 2 bracci che serve per il prelievo del campione: di questi 2 bracci uno preleva il campione e lo porta in un’altra provetta dell’apparecchio che poi lo processerà, dopo questo “sputa” il puntale utilizzato e questo braccio deve essere lavato per evitare 4

Patologia clinica lezione 1 prof. Oriente 08/04/2021 contaminazioni. Ad occuparsi del lavaggio di questo è il braccio di lavaggio che lo disinfetta in modo che può ricominciare il suo ciclo.

Durante la fase analitica occorre sempre:

Apparecchiature siano ben funzionanti

Uso degli standard o dei calibratori adeguati in modo da permettere un’analisi precisa del risultato.

Controllo dei reagenti: etichette con le proprie specifiche e la data di scadenza. Le macchine si suddividono in: a reagenti aperti e a reagenti chiusi.

Nel caso dei reagenti aperti si possono utilizzare soluzioni diverse. costi inferiori. sempre chiamare l’assistenza tecnica. Nel caso dei reagenti chiusi: solo soluzioni specifiche dell’apparecchio costano di più Nessuna spesa per l’assistenza tecnica.

Fase post analitica

Smaltimento campioni processati

Trasmissione dati

Elaborazione statistica dati: La fase postanalitica è la fase in cui il risultato della reazione viene inviato ad un computer, il quale generalmente lo riporta sotto forma numerica. In questo caso il dato deve essere acquisito e calcolato. Attualmente tramite computer è possibile fare un’analisi statistica e di riportare i dati sotto forma di grafici (istogrammi o curve gaussiane). 5

Patologia clinica lezione 2 12/04/2021

Il sangue

Il sangue è un tessuto connettivo a carattere fluido di caratteristico colore rosso che scorre in un sistema di canali comunicanti (vasi arteriosi e venosi); costituisce circa 1/12 del peso corporeo.

Funzioni del sangue:

• Funzione respiratoria
• Distribuisce sostanze nutritizie assorbite nell’intestino (aminoacidi, zuccheri, Sali minerali)
• Trasporta i prodotti del catabolismo che verranno eliminati attraverso reni o elaborati attraverso il fegato
• Trasporta ormoni a specifico tessuti bersaglio
• Difende il corpo dalle tossine e dai patogeni (immunità specifica e innata)
• Contribuisce a regolare la temperatura corporea
• Partecipa alla riparazione dei vasi sanguigni lesionati

Esso è costituito da una parte corpuscolata formata da cellule definite globuli (45%) in un liquido chiamato plasma (55%).

Differenza tra plasma e siero

Il plasma è un liquido giallastro leggermente alcalino (pH 7,4) che rimane dopo che al sangue sono state eliminate le cellule mediante coagulazione. Per poter essere conservato, deve essere trattato con anticoagulanti. È costituito da 90% di acqua e 10% da sostanza secca:

La sostanza secca è formata al 90% da sostanze organiche

• Glucidi (glucosio)
• Lipidi (colesterolo, trigliceridi, fosfolipidi)
• Proteine (globuline, albumine, fibrinogeno)
• Ormoni (gonadotropine, eritropoietina, trombopoietina)
• Amminoacidi
• Vitamine

Mentre il 10% è costituita da minerali, dissolti sotto forma ionica

Il siero, invece, è il plasma privo di fibrinogeno, una proteina, che trasformandosi in fibrina, provoca la coagulazione. É la parte non corpuscolata del sangue che si separa da questo dopo la coagulazione. Può essere conservato senza che si coaguli.

Il sistema emopoietico

L’ematopoiesi è la produzione delle cellule del sangue (eritrociti, leucociti e piastrine)

Inizia al 14° giorno della vita fetale

É un processo gerarchico che origina da una rara cellula ematopoietica staminale (HSC)

Dopo la nascita questo procedimento avviene quasi esclusivamente nel midollo osseo

Nell’adulto il tessuto midollare sta nelle ossa piatte (bacino, sterno, coste vertebre e estremità prossimali 6

Patologia clinica lezione 2 12/04/2021 omero e femore)

Man mano che si cresce viene sostituito dal tessuto adiposo

Le cellule staminali sono cellule pluripotenti non specializzate capaci di dividersi in modo asimmetrico originando:

• Una cellula staminale identica alla cellula madre
• Una cellula staminale multipotente incapaci di rinnovarsi in maniera definitiva

Si generali così progenitori commissionati che proliferano e maturano, generando diverse linee emopoietiche

L’emopoiesi è guidata da meccanismi molecolari che inducono differenziamento e mutazione cellulare attraverso la regolazione della trascrizione genica. Questo processo è regolato da fattori di crescita, differenziazione e maturazione. Ligandi dei recettori posti sulla superficie delle cellule staminali e progenitori)

Le cellule staminali e i progenitori commissionati si identificano in base all’espressione di molecole di membrana riconosciute da anticorpi monoclonali (per esempio CD34 correlato alla capacità delle cellule di rigenerare il sistema emopoietico)

Risiedono nel midollo emopoietico

Circolano nel sangue

I fattori positivi di crescita e differenziazione possono essere prodotti nel midollo osseo o altrove

Il turnover delle cellule del sangue è:

Eritrocita 120 gg; piastrine 10 gg e granulociti neutrofili 12 ore

Globuli rossi

Globuli rossi sono cellule prive di nucleo ed organelli ed hanno una forma biconcava a forma di ciambella Diametro

Contengono emoglobina

5.4 milioni/mm3 nell’uomo 7.5 µm

4.5 milioni/mm3 nella donna

Emivita di 120 giorni

Funzioni: trasporto ossigeno nei tessuti ed eliminare anidride carbonica dai tessuti.

L’emoglobina è una grossa molecola che si forma nel midollo osseo a partire da due componenti: l’EME e la GLOBINA, una proteina composta da 4 subunità

L’eme è un gruppo prostetico costituito da PORFIRINA (4 anelli pirrolici) contente al centro un atomo di Fe2+ che può legare ossigeno in modo reversibile. 7

Patologia clinica lezione 2 12/04/2021 La funzione dell’Hb è quella di trasportare l’O dagli alveoli polmonari ai tessuti periferici e la CO dai tessuti2 2 periferici ai polmoni dove avviene lo scambio O CO→2 2

L’eme è prodotta nel midollo osseo o dal fegato e viene sintetizzato NON dagli eritrociti maturi ma dai loro precursori soprattutto a livello del midollo osseo

Il ferro centrale lega l’ossigeno solo nello stato di ossidazione +2 (ferroso).

Esistono vari tipi di emoglobina a seconda dello stato evolutivo dell’essere umano:

Emoglobina fetale avremo 2 catene alfa e 2 gamma

Nell’adulto il tipo più abbondante è emoglobina A, ma c’è anche emoglobina A2 e l’emoglobina fetale (2%).

Emoglobina fetale (HbF) ➢ a g2 2

Emoglobina adulto ➢ a b (96%) HbA12 2 ➢ a d (2%) HbA22 2 ➢ a g (2%) HbF2 2

L’eritropoiesi è la formazione e maturazione dei globuli rossi che dura 7 giorni, avviene nel midollo osseo e viene regolata dall’eritropoietina.

Eritropoietina è una glicoproteina di 46kDa prodotta dal rene e va ad aumentare la velocità di sintesi dell’emoglobina negli eritroblasti, ma anche della sintesi proteica non emoglobinica.

Aumenta in caso di minor quantità di O , anemia, gravidanza, ipoplasia midollare.2

Le cellule endoteliali dei capillari perit