Molecular cellular and tissue engineering

09.03.2020

La bioingegneria ha uno spettro molto ampio di applicazioni. Medicina rigenerativa e ingegneria tissutale.

Approccio ingegneristico per andare ad individuare e sviluppare innovazioni terapeutiche.

Conoscenze di base per muoversi nell’ambito.

Andremo a toccare diversi ambiti. Nozioni di chimica e biochimica per comprendere come funzionano i meccanismi alla base della fisiologia dell’organismo e alla base delle patologie.

Parleremo di ingegneria genetica: conoscere come l’informazione genetica viene trasmessa agli organismi, come viene esplicata la conoscenza racchiusa nel DNA. Tecnica che ci permette di manipolare e controllare l’informazione genica a fini terapeutici.

Cellule staminali: argomento molto discusso. Biomateriali: componente strutturale, matrice extracellulare che dovrà essere sostituita con un materiale artificiale che possa essere impiantato nell’uomo senza provocare una reazione avversa ma agendo in modo attivo.

Slide 11

Individuo come punto di partenza. Obiettivo: rigenerare organo o tessuto danneggiato senza dover ricorrere a trapianti o protesi. Attivare un meccanismo di autoriparazione laddove questo meccanismo non avverrebbe in modo naturale.

Idea generale: isolare dal paziente un pool di cellule (autologhe). Devo portarle in laboratorio e saperle manipolare, coltivarle, espanderle. La maggior parte delle cellule ha potere proliferativo, altre no (es. neuroni). La cellula dovrà andare ad interfacciarsi con il biomateriale o scaffold. Devo utilizzare un approccio biomimetico. Struttura e strategia ben precisa a seconda del tessuto che andrò a rigenerare.

Aggiungere ingredienti che aiutano la cellula ad interfacciarsi con il materiale artificiale. Organizzazione in pseudo tessuto, bioreattore. Quando il riconoscimento è positivo e attivo posso pensare di prendere il tessuto ingegnerizzato e impiantarlo in uomo, dando il via a un processo di rigenerazione che altrimenti non avverrebbe.

Sviluppi

La medicina moderna è frutto dei progressi sviluppati all’inizio del secolo scorso. Anestetici e antibiotici. Passare dalla rimozione ad una ricostruzione.

Trapianto autologo: trapianti in cui vengono utilizzati tessuti del paziente stesso. Trapianti di pelle. Bypass aorto-coronarico. Problemi legati al rigetto evitati in questo modo.

Limiti: disponibilità legata al tessuto. Non posso creare danno in un posto sano per intervenire. Danni dovuti a patologie, il tessuto porterà comunque quell’informazione genetica errata.

Trapianto allogenico: tessuto proveniente da altri donatori. Sviluppo di farmaci anti rigetto, controllano la risposta immunitaria del paziente ricevente. Progressi che hanno consentito di aumentare in modo considerevole la percentuale di sopravvivenza del paziente sottoposto al trapianto.

Limiti: rigetto cronico. I farmaci anti rigetto hanno un’attività neoplastica, un paziente che si sottopone a terapie antirigetto ha possibilità maggiore di sviluppare tumori nella sua vita. Questo limita la possibilità di utilizzare questa terapia. Sono più i pazienti in attesa di ricevere il trapianto di quelli che potranno effettivamente beneficiare degli organi donati.

Xenotrapianto: organo o tessuto proveniente da un animale.

Limitazioni: questione di natura etica. Rigetto iperacuto, forma di rigetto molto rapida, il tessuto ripiantato viene rapidamente riconosciuto dal sistema immunitario (nei primissimi minuti) e il trapianto fallisce. Potenziale trasferimento di agenti patogeni dall’animale all’uomo, che impiantato nell’uomo può ricombinarsi e sviluppare patologie.

Organi artificiali

Approccio che sta andando spegnendosi perché è molto complesso pensare di riprodurre in modo artificiale tutto il pool di meccanismi di un organo.

Ingegneria tissutale

Ricomporre in vitro un tessuto che una volta trapiantato sul paziente può sostituire quello danneggiato, favorire o innescare un’azione di riparazione che spontaneamente non avverrebbe. Campo altamente interdisciplinare e multidisciplinare.

Partiremo dal punto di vista molecolare. Molecole: mattoncini che determinano il corretto o scorretto funzionamento del tessuto.

Biomolecole

Guardarle con l’occhio dell’ingegnere. Parleremo di carboidrati, di lipidi e di proteine.

DNA ricombinante e OGM

Trasmissione e traduzione dell’informazione genetica.

Terapia genica

Manipolare l’informazione nei geni. Correggere l’errore nei geni.

Cellule: unità fondamentale della vita

Cellule funzionali che svolgono un determinato lavoro. Partendo dallo sviluppo embrionale, la cellula si va a sviluppare in una determinata funzione e quindi una determinata morfologia. Paradigma struttura – funzione. Morfologia esplicata dall’informazione genetica. Le cellule dello stesso individuo hanno tutte lo stesso patrimonio genetico che viene espresso in modo differenziato a seconda del lavoro che la cellula deve svolgere.

La cellula è come se fosse un grande reattore suddiviso in tanti compartimenti, delimitati, che svolgono funzioni e reazioni specifiche. Il fatto che la cellula sia specializzata in questo modo permette che tante reazioni vengano condotte contemporaneamente.

Cellule staminali

Una caratteristica è quella che le accomuna alle cellule tumorali. Proliferazione incontrollata delle cellule. Perde l’inibizione da contatto. Uno dei punti da controllare per le cellule staminali.

Terapia cellulare

Devo avere idea di come sviluppare un materiale che non lo mima la matrice extra cellulare ma che una volta reimpiantato sull’uomo possa essere accettato dall’organismo dove si troverà esposto ad un ambiente attivo dal punto di vista metabolico. Dovrà essere un materiale accettato in modo positivo e attivo.

Scaffold

Supporto che dobbiamo fornire alla cellula. La cellula lo deve riconoscere per poi aderire per svolgere la sua funzione nel modo corretto.

Struttura – funzione

Esempio con le proteine, una determinata sequenza di condoni determina una determinata proteina con una determinata funzione.

Superfici

Le cellule del nostro organismo crescono tutte adese, tranne quelle del sangue. Ma per aderire devono riconoscere la superficie.

Il nostro materiale deve essere biocompatibile. Definizione complessa. Un materiale è biocompatibile se svolge in modo corretto una funzione specifica.

Bioreattori

A seconda del tessuto che voglio dovrò dare uno stimolo preciso per quel tipo di tessuto.

12.03.2020

Biomolecole

Sono i mattoncini che costituiscono e che danno particolari funzionalità all’organismo.

Composti del carbonio: il C si distingue per la capacità di formare grandi molecole. Può stabilire legami covalenti con altri atomi e con se stesso, può dare luogo a molecole di dimensioni enormi.

I lipidi non possono essere definiti polimeri, le altre macromolecole sì.

Funzioni

• Carboidrati: riserva energetica + supporto strutturale.
• Lipidi: riserva energetica + protezione.
• Proteine: supporto strutturale + protezione + trasporto + ecc.
• Acidi nucleici: informazione genetica.

Carboidrati

Siamo interessati ai polisaccaridi. Unità monomerica, catena aperta e catena ciclica. Legame glicosidico dei disaccaridi.

Funzioni dei polisaccaridi

• Polisaccaridi di riserva.
• Polisaccaridi di sostegno.
• Polisaccaridi complessi -> glicoproteine.

Ogni monosaccaride presenta molti gruppi ossidrilici liberi. I polisaccaridi sono insolubili o poco solubili in acqua perché i gruppi ossidrilici interagiscono creando ponti idrogeno e impedendo la dissoluzione in acqua.

Cellulosa: funzione di sostegno nelle piante. È insolubile in acqua. Per essere utilizzata deve essere lavorata fisicamente o chimicamente. Fisicamente: viene spezzettata per disperdersi in acqua. Oppure metilazione dei gruppi ossidrile che diminuisce le interazioni rendendola più solubile ma è un colloide, non una soluzione (impiego nei colliri, per renderli più viscosi).

Alginato: deriva dall’alga bruna ed è un polisaccaride lineare costituito da due unità monomeriche: acido e acido (vedi slide) che si alternano nella catena lineare. Molto utilizzato nell’industria alimentare, è un gelificante. Alginato è solubile in acqua ma ha la caratteristica di creare dei gel.

Chitina: polisaccaride naturale (animale) molto interessante. Costituente dell’esoscheletro di crostacei e insetti. Prodotto a basso costo, scarto dell’industria alimentare. Chitina insolubile in solventi organici.

Chitosano: si ottiene tramite deacetilazione della chitina condotto con idrossido di sodio che conferisce proprietà interessanti a questo materiale che viene dotato di gruppi amminici che per pH < 6 possono essere deprotonati e rendono il materiale solubile in acqua e quindi può essere facilmente lavorato. Non solo presenta gruppi ossidrilici (reattivi) ma presenta gruppi amminici, cosa ancora più interessante. Troviamo una caratteristica delle proteine. Adesione delle cellule mediata da proteine, abbiamo un polisaccaride che può svolgere parzialmente questa attività: usiamo chitosano in combinazione con neuroni.

Gelificazione del chitosano

Anche il chitosano può gelificare. Utilizzato in campo farmaceutico, bendaggi. Il chitosano ha una carica positiva (gruppi amminici), viene utilizzato per le sue proprietà emostatiche perché i globuli rossi hanno una carica negativa che vengono richiamate dal cerotto chitosano che è positivo e si facilita la guarigione. La membrana dei batteri è una membrana con una carica negativa, quindi il chitosano attrae anche i batteri che non possono moltiplicarsi quindi ha anche funzione antibatterica.

Acido ialuronico: polisaccaride lineare, si trova nel tessuto connettivo, tessuti di riempimento, cartilagine. Si ottiene non solo dagli animali (cresta del gallo) ma per le applicazioni sull’uomo si può ottenere anche per fermentazione batterica. Utilizzato nell’industria farmaceutica. È molto solubile in acqua. Viene modificato e si producono degli esteri che permettono di avere stabilità. Utilizzato anche in ingegneria tissutale.

Lipidi

Classe ampia ed eterogenea di sostanze. Sono insolubili in acqua, sono solubili solo in sostanze apolari (cloroformio). Funzione di riserva, regolatoria, strutturale. Fosfolipidi: componenti della membrana cellulare. Natura anfipatica, anfifilica. Testa polare e coda apolare. Da un punto di vista energetica si dispongono in un certo modo.

Liposomi

Prima applicazione bionanotecnologica. All’interno sono in grado di accogliere molecole farmacologicamente attive idrofiliche ma possono trasportare molecole idrofobiche.

Proteine

Svolgono funzioni biologiche molto differenti tra di loro. 20 amminoacidi diversi. Legame peptidico.

Dogma centrale

L’informazione contenuta nel DNA è l’informazione di quella che deve essere la struttura di come va costruita una proteina.

Il DNA è capace di duplicarsi e tramite RNA porta alla sintesi delle proteine.

Forma e dimensione differente delle proteine.

Possono essere classificate in due gruppi: globulari e fibrose.

Globulari: forma sferica, svolgono ruoli funzionali (enzimi, ormoni, proteine di trasporto, ecc.).

Fibrose: si dispongono in foglietti e svolgono funzioni di carattere strutturale.

Conoscere la possibilità di inibire un’enzima è importante a scopo farmaceutico.

Enzimi hanno grandi applicazioni in campi industriali perché sono dei catalizzatori più specifici. Sono biologici quindi non hanno un impatto ambientale. Hanno costi minori perché possono essere prodotti per fermentazione batterica. Biodegradabili.

Gli enzimi nel nostro organismo lavorano a temperature basse (temperatura corporea) e a pH neutro. Gli enzimi non si consumano.

Enzimi utilizzati nell’industria dei detergenti. Lipasi: scindono i grassi. Questi enzimi possono essere prodotti tramite fermentazione batterica e utilizzati nei detersivi.

Igiene personale: dentifrici addizionati con enzimi in grado di attaccare batteri che causano le carie.

16.03.2020

Proteine fibrose

Il collagene è uno dei materiali più utilizzati per ingegneria tissutale, è stato uno dei primi materiali utilizzati.

Apligraf: prima pelle bio – ingegnerizzata. Sostituto per la rigenerazione dell’epitelio.

Acidi nucleici

La cellula è l’unità fondamentale di tutti gli organismi viventi.

Primo esperimento

Premessa: batterio stafilococco assume due forme che differiscono per l’aspetto e per la loro capacità di provocare la polmonite. Le cellule del ceppo patogeno sono avvolte da una capsula polisaccaridiche (cerchietto grigio), chiamato ceppo S (smooth). Ceppo iniettato nel topo che sviluppa polmonite. L’altro ceppo non patogeno non ha quel rivestimento polisaccaridico e se messo in colonia produce cupole piatte e ruvide, R (roof).

Uccido le rosse con il calore, le mischio con le cellule non patogene, le inietto nel topo e il topo sviluppa la polmonite.

Con il calore vado a denaturare le proteine che sono fondamentali perché il batterio svolga la sua funzionalità.

1952 -> DNA è la molecola che porta l’informazione genetica.

Batteri di escherichia coli, virus costituito da DNA e proteine, si comporta come una siringa (?). Per determinare se il materiale genetico fosse proteina o DNA marcano con dei marcatori radioattivi: proteine rosse e DNA blu. Prendono i virus e li mettono in contatto con le cellule di escherichia coli per un tempo necessario affinché il virus si attacchi alla membrana batterica e si mischi all’interno. Centrifuga per staccare l’involucro dal batterio e vanno a vedere (?).

19.03.2020

DNA: molecola che conserva l’informazione genetica e la trasmette.

Acidi nucleici

DNA molecola che conserva le informazioni ereditarie.

RNA ruolo funzionale nei processi di espressione genetica che portano alla sintesi delle proteine.

Il DNA conserva l’informazione genetica che attraverso l’RNA viene tradotta in proteine.

Geni: porzioni di DNA che contengono le informazioni per la sintesi di una determinata proteina.

Non tutto il DNA è codificante.

DNA non solo contiene l’informazione ma ha anche la capacità di replicarsi.

Struttura primaria

È alla base del successo di una molecola nella trasmissione dell’informazione genetica.

Gli acidi nucleici sono dei biopolimeri dove il monomero è un nucleotide: pentoso (zucchero a 5C) + base ciclica + gruppo fosfato. Desossiribosio per DNA e ribosio per RNA. Zucchero in forma chiusa tra C1 e C4, per cui C5 rimane fuori dall’anello. A C1 è legata una delle 4 basi e al C5 è legato l’acido fosforico.

Le basi si dividono in puriniche e pirimidiniche.

I nucleotidi sono legati tra loro a costituire la struttura primaria, che è la sequenza dei nucleotidi che vengono identificati con la lettera della base corrispondente. Legame covalente fosfodiesterico tra i vari nucleotidi, legame covalente: un atomo di fosforo è legato ad altre due molecole tramite due legami esterei.

Quando si legge la struttura primaria di un acido nucleico si parte dall’estremità 5 andando verso l’estremità 3.

Struttura primaria: codice per immagazzinare l’informazione genetica.

Struttura primaria

Funzione codificatrice. Ogni tripletta (ogni 3 nucleotidi) è un codone. Ogni codone codifica per un singolo amminoacido. Codoni appositi per inizio e fine.

Gene: tratto di DNA che codifica per una proteina. Il gene contiene anche delle sequenze che chiamiamo regolatrici, dicono dove inizia e dove finisce l’informazione che porta alla sintesi della proteina, oppure sono sequenze regolatrici, sulla potenza di espressione.

Codice a 4 lettere, è un alfabeto.

Le dimensioni di un genoma vengono misurate in coppie di nucleotidi, 2 lettere, di DNA aploide.

Tutte le cellule somatiche, escluse quelle germinali, hanno nel nucleo 2 copie del genoma: uno dalla madre e uno dal padre. Quando si conta la dimensione del genoma di un organismo ci si riferisce al numero di copie nucleotidiche del genoma aploide (considerando solo una copia).

In genere il genoma è tanto maggiore più un organismo è complesso. Ma questo non si verifica sempre.

Il DNA è impacchettato nei cromosomi (uomo 46, 23 coppie).

La sequenza delle lettere mi dà la struttura primaria della proteina stessa.

Struttura secondaria

Differisce tra DNA e RNA. Il DNA è una molecola a doppio filamento, RNA catena singola che si ripiega su se stessa. Il DNA è composto da 2 catene antiparallele tenute e associate da legami a H che si stabiliscono tra le basi. I legami a H si stabiliscono con una certa efficienza solo tra alcune basi. In questo sta la forza del codice. Se conosco la sequenza di un filamento posso ricostruire la sequenza complementare, basandomi sull’appaiamento specifico tra le basi: 2 legami H tra A e T, 3 legami H tra G e C.

Doppia elica tenuta insieme dai legami H e da interazioni deboli che si vengono a stabilire tra le basi impilate. Scheletro molto stabile (zucchero + fosfato) tenuto insieme da legami covalenti e le due catene sono tenute insieme da legami più deboli.

È fondamentale aver presente la struttura primaria e secondaria per poterne comprendere la funzione.

L’informazione deve essere accessibile quindi le due catene devono facilmente svolgersi e aprirsi, i legami devono rompersi, per poter rendere disponibile l’informazione.

Denaturazione

Se fornisco calore alla doppia elica, ho una temperatura di denaturazione che dipende della lunghezza della catena. Se do calore rompo i legami H e posso separare i due filamenti, se raffreddo la doppia elica si riforma.

L’RNA è una struttura più stabile, ha bisogno di più calore rispetto al DNA e questo è dovuto al fatto che l’RNA ha una funzione regolatrice. La struttura secondaria dell’RNA è data dal ripiegamento della catena lineare su se stessa, dando vita a diversi motivi.