Microbiologia II

Microbiologia III

Fagi, trascrizione e nucleoide

I fagi della classe T sono i più studiati (tra questi quelli più conosciuti sono il T4 e il T7), la lunghezza della ORF è arbitraria, nei procarioti non esiste la TATA-box ma la Pribnow box a -10 o -35 a cui si lega il fattore sigma, a -6 rispetto all’ATG troviamo una sequenza più o meno degenerata AGGAGG definita ribosome binding site, la sequenza TATAAT è quella a massima efficienza ma non si trova quasi mai e presenta sempre delle modifiche nucleotidiche, a monte del promotore è presente una sequenza UP ricca in AT che è riconosciuta dalla subunità alfa della RNAP (come tutte le sequenze ricche in AT) e stabilizza il complesso per la trascrizione.

Il DNA del nucleoide presenta delle proteine simili agli istoni (HLP) che ripiegano l’acido, il numero delle anse dipende dalle condizioni ambientali e dallo stadio di sviluppo (nucleoide struttura dinamica), la parete cellulare è composta da peptidoglicani (presente anche nella cartilagine ialina ed è correlato ad alcune malattie immunitarie).

Citoscheletro batterico e morfologia

Anche nell’actina esiste un meccanismo di polimerizzazione e depolimerizzazione caratteristico dei microtubuli (l’actina utilizza ATP mentre i microtubuli il GTP), il mutante del Coli è dato da una forma arrotondata (morfologicamente simile a un cocco) che è causato da un’alterazione nel gene mreB (proteina simile all’actina, ALP), lo stesso gene mutato in un cocco fa assumere al microrganismo una forma a bastoncello.

Questa proteina si dispone longitudinalmente a forma elicoidale lungo tutto il Coli e durante la replicazione la fase di allungamento del bastoncello è preceduta da una sintesi elevata di MreB che si dispone sempre elicoidalmente (accrescimento dell’elicoide), la proteina simile all’actina ParM, insieme a MreB, ha subito un processo di evoluzione convergente (in quanto è costituita da sequenze completamente diverse dall’actina e con aa diversi da quelli che compongono l’actina ma la sua struttura è simile a quest’ultima e anche il suo ruolo).

La crescentina, precisamente la CreS, si dispone su un lato dell’organismo in cui è presente, il caudobacter crescentus, se viene mutata porta alla morfologia a bastoncello del mutante (il caudobacter è a forma di bastoncello ripiegato poiché l’unico flagello presente può essere sfruttato maggiormente nel movimento in quanto permette di ruotare anche il batterio), questo batterio presenta sia una forma sessile che flagellare (batterio migrante).

Con la microscopia confocale ci permette di osservare strutture citoscheletriche e proteine, il citoscheletro batterico è utile conoscerlo per un eventuale target di un antibiotico contro una proteina del microrganismo.

Divisione cellulare e FtsZ

FtsZ (simile alla tubulina o TLF, costituito da un singolo filamento lineare) che formerà un anello (anello Z) che si produce durante la fissione al centro della cellula in divisione in una zona detta setto di scissione, in questa regione avviene la spartizione del nucleoide duplicato nelle figlie e alla fine il setto si richiude.

La divisione canonica comprende una cellula madre che si divide in due cellule figlie, in alcuni batteri come Pirella e Blastobacter esiste la gemmazione in cui una madre invecchiata produce una figlia da una parte di citoplasma che può essere adiacente alla cellula madre o separata da una lunga protrusione citoplasmatica detta ifa, oppure come il caudobacter sul suolo risiede una cellula madre che una volta che consuma tutte le risorse nutritive in loco si divide in una cellula flagellata.

La curva di crescita dei batteri è data dalla N(t)=N*2^(t/td) (t=istante t, td=tempo di scissione), questa è una curva ideale che non risponde alla realtà in quanto ogni batterio presenta una curva differente e la velocità con cui una divisione avviene è dipendente dalle condizioni di vita dell’organismo.

I mutanti che influenzano la divisione cellulare (mutanti filamentating temperature sensitive) possono essere classificati in base alle modalità di mutagenizzazione:

• FtsZ (proteina essenziale per il setto), in cui si assiste alla formazione di batteri lineari senza setto.
• FtsA, in cui i mutanti lineari formano setti iniziali.
• FtsI, in cui vanno incontro a lisi (gene che è coinvolto nella sintesi di peptidoglicano durante la divisione e in particolare degrada peptidoglicani per l’allungamento e per permettere la sintesi di nuovi peptidoglicani, la mutazione provoca fratture nella maglia glicanica e l’acqua entra per osmosi).

FtsZ è una GTPasi e prima componente del divisoma e permette l’invaginazione del setto, due ipotesi sulla formazione del setto: ipotesi del PUSH in cui il peptidoglicano in sintesi spinge dentro FtsZ e quella del PULL in cui FtsZ tira il peptidoglicano all’interno dell’invaginazione (quella più accreditata).

Un residuo detto T7 loop si inserisce in una tasca in cui risiede il nucleotide del monomero successivo una volta avvenuta la fosforilazione del GDP, in seguito a defosforilazione del sito ogni monomero non si stacca immediatamente, come la tubulina, ma forma delle strutture ripiegate che risultano macroscopicamente nell’insieme una struttura circolare e dopo alcuni minuti si allontanano, l’anello Z dopo la divisione si sposta immediatamente al centro della cellula figlia nuovamente in divisione, FtsA mutata stabilizza i filamenti e non si possono defosforilare.

Probabilmente FtsZ può intervenire nella formazione dell’anello Z per mezzo di monorotaie fatte di MreB, formazione dell’anello 3 ipotesi:

• FtsZ, libere nel citoplasma, in risposta a segnali molecolari, polimerizzano un unico filamento al centro della cellula o direttamente in loco o formando dei filamenti nel citoplasma che si appaiono a livello dello Z-ring.
• FtsZ si appaiono in protofilamenti affiancati e legati tramite proteine SlmA.
• FtsZ non deve essere polimerizzata ma esiste sottoforma di spirale e durante la citochinesi si comprime per mezzo dello scorrimento dei filamenti l’un l’altro con la sottrazione di monomeri.

Posizionamento dell’anello Z

Posizionamento dell’anello Z:

• Grazie a un localizzatore topologico proteico (ZipA, dedotta dal fatto che è una proteina transmembrana).
• Esistono degli anelli perisettali, ovvero delle tracce di maglie al centro della membrana in cui i 3 componenti della membrana sono fusi tra loro (solo nei bacilli).
• Occlusione del nucleoide, in cui la proteina SlmA, legata al DNA, rapisce FtsZ e non permette lo Z-ring al centro, una volta che il nucleoide si è diviso il DNA non è più situato al centro e SlmA non si lega più al DNA e lascia libera FtsZ a formare lo Z-ring.

Modello MinCDE, in cui i mutanti avevano il setto ad un’estremità e si formavano una macrocellula, che presentava due nucleoidi e il plasmide inserito, e una minicellula senza DNA ma con tutte le proteine dei geni housekeeping e il plasmide (utili per la purificazione di plasmidi), i geni coinvolti sono minC minD minE.

I mutanti minD (ATPasi nel citosol che si attacca alla membrana in un punto aspecifico e si lega a minC, a questo punto il complesso minCD-ATP determina l’inibizione della formazione dell’anello da parte di FtsZ) vanno incontro a formazioni del setto anomale formando minicells, la delezione dell’intero locus determina il medesimo fenotipo.

MinE interagisce con il complesso stimolando l’attività ATPasica inibendo l’interazione tra minC e minD e dissocia minD dalla membrana, minE è concentrato nella regione centrale della cellula e si sposta oscillando verso un’estremità della cellula per poi scomparire e ricomparire al centro della cellula e di qui si sposta nuovamente verso il polo opposto, il moto della proteina è continuo e in stato di non attiva proliferazione è rallentato.

Anche minC e minD oscillano e sembrano spinti da minE in quanto il suo movimento è in ritardo rispetto ai primi due, in quanto minE deve provocare l’inibizione del complesso ATPasico, e questo moto oscillatorio provoca una maggiore probabilità di formazione dell’anello al centro, forse minCD si forma su MreB e lo usa come binario quindi tutti i componenti finora esposti viaggiano sulle monorotaie di MreB, il citoscheletro batterico quindi è coinvolto nel trasporto dei componenti del batterio.

Sistema SOS e mutazioni condizionali

Per mutare organismi bisogna indurli a vivere in condizioni sfavorevoli rendendoli mutanti condizionali (ad esempio mutazioni temperatura sensibili), la divisione cellulare manifesta un’apprezzabile correlazione con la replicazione del DNA e con il partitioning, la divisione cellulare si blocca, in particolare, quando la cellula riporta alcuni danni al proprio DNA.

Questo fenomeno è ben conosciuto ed è dato dal sistema genico SOS che non viene espresso a causa del repressore lexA, in caso di stress recA, stimolato da un DNA tronco a singolo filamento, interagisce con lexA che induce la sua degradazione per mezzo del suo sito di autodegradazione, a questo punto sulA viene espresso e inibisce la polimerizzazione di FtsZ.

Il plasmide F presenta delle proteine che mascherano le estremità che entrano e non vengono riconosciute mentre il batteriofago una volta entrato produce proteine simili a lexA che reprimono il sistema SOS, sulA forma un dimero e lega FtsZ in cui risiedono 2 subunità T7-loop a cui si legano FtsZ impedendo la polimerizzazione.

Nucleoide e replicazione del DNA

Cairns scoprì l’esistenza delle forche replicative con l’induzione della radioattività del DNA per creare una fluorescenza che si distingue su uno sfondo oscurato di una microfotografia del vetrino cosparsi di gelatina tipica delle macchinette Kodak, ad ogni forca corrispondeva una bolla replicativa che si generava in seguito alla replicazione.

Il nucleoide batterico è costituito da numerose anse (circa 100 nell’E.Coli) che si collegano a un nucleo proteico la cui composizione è ancora sconosciuta, il DNA batterico si denatura subito in seguito alla lisi, il DNA di natura possiede un superavvolgimento negativo per la compattazione istonica, i superavvolgimenti negativi sono permessi grazie alle topoisomerasi, ogni ansa possiede un superavvolgimento indipendente topologicamente dalle altre.

Anche per lo studio della replicazione bisogna utilizzare l’approccio genetico: selezione di mutanti condizionali letali per i geni coinvolti nella replicazione attraverso:

• Screening di mutanti incapaci di incorporare 3H a temperature non permissive (verranno incorporati solo da quelli che hanno una replicazione normale).
• Selezione di cloni insensibili (più efficiente) all’infezione di alcuni fagi a temperature non permissive (verranno uccise le cellule che non avranno una replicazione effettiva).
• Selezione di cloni resistenti a mutageni a dosi letali a temperature non permissive (solo quelli che hanno un macchinario di replicazione attivo potranno essere mutagenizzati, es. 5-Br-U-OH).

Sono stati anche utilizzati approcci biochimici-fisiologici attraverso una selezione di frazioni proteiche e proteine in grado di complementare, in vitro, la mancanza di fattori essenziali alla replicazione su un disco di cellophane di Bonhoffer o su un sistema in vitro di Kornberg.

La replicazione batterica inizia in un unico punto ai poli opposti, l’origine di replicazione è stata ottenuta mediante:

• Analisi di delezione (la regione responsabile della replicazione non può essere deleta).
• Analisi dei geni localizzati nei pressi dell’ipotetica origine di replicazione (sono maggiormente espressi perché presenti in un numero di copie maggiore).

Una forca replicativa batterica di una cellula in attiva proliferazione parte ogni 20’ (più di una bolla replicativa) mentre si divide ogni 40-45’ (non si può dire con certezza che un batterio sia aploide), un altro strumento d’analisi può essere il clonaggio della regione d’inizio della replicazione in un plasmide privo di proprio replicone (solo in questo modo sarà stabilmente mantenuto in una cellula batterica ed è l’unica caratteristica che fa di questa struttura un plasmide), esistono anche plasmidi lineari.

Origine di replicazione oriC

L’origine di replicazione di Coli si chiama oriC, una volta frammentato il nucleoide tramite enzimi di restrizione (es. BamH1) si formeranno frammenti, in uno di questi ci sarà l’ori, con cui verranno legati tramite ligasi a un plasmide frammentato a sua volta con la resistenza all’ampicillina.

In seguito si è scoperto l’origine di replicazione e l’unità minima di replicazione (245bp) ricca in AT con 8 regioni di legame per la DnaA di cui 3 ad alta affinità (R1, R2, R4 a cui si lega indipendentemente dalle situazioni in cui si trova), 2 a minore affinità (R3, R5) e 3 ad affinità specifica in quanto vengono legati solamente quando DnaA si lega ad ATP (I1, I2, I3) e ciò favorisce un legame cooperativo, ovvero il legame della DnaA ai siti R3-5, infine un sito per IHF e uno per FIS.

Sono presenti sequenze GATC sensibili alla metilasi dam (metilazione della A nel filamento parentale durante la replicazione), la DnaA interagisce con la N-terminale lega l’elicasi e la C-terminale alla DNA pol, con la parte centrale si lega all’ATP essa ha una struttura elicoidale e costituisce un rocchetto per il DNA inducendo uno stress torsionale negativo e aprendo per prima la sequenza ricca in AT per poi arrivare l’elicasi, caricatore della pinza gamma (un dimero che circonda il DNA), pinza beta e gli altri componenti.

Esistono vari modelli dei regolatori della replicazione (firing): titolazione della forma libera della proteina DnaA da parte del sito datA, regolazione trascrizionale di DnaA, sequestro dell’origine di replicazione da parte della membrana di SeqA (le regioni oriC è ricca di sequenza GATC che possono essere metilate dalla dam metilasi sull’A, la natura della replicazione di tipo semiconservativa determina un DNA neosintetizzato di tipo emimetilato, il DNA viene rimetilato in circa 3’ e quello della regione oriC impiega 12-13’, questo ritardo è dovuto al legame di questa regione della proteina SeqA che si lega saldamente al DNA emimetilato, la proteina DnaA si lega al DNA della regione oriC quando questo è completamente metilato).

Si dice che SeqA si lega alla forca e la porta sulla membrana, ipotesi del controllo mediato: DnaA-ATP interagisce con la membrana in base alla composizione della membrana si può misurare l’attività della proteina (se la membrana è composta prevalentemente di fosfolipidi basici, come lisilfosfatidilglicerolo il complesso con ATP è stabile mentre se troviamo fosfogliceridi acidi, come cardiolipina e fosfatidilglicerolo, perché si sta accrescendo si favorisce la defosforilazione dell’ATP).

Controllo RDA in cui l’allungamento è favorito dalla proteina Hda che si fissa sull’elicasi ed espone Dna-ATP ne induce la defosforilazione che fa sciogliere il toroide (la struttura dell’enzima) così l’elicasi può svolgere la doppia elica, la concentrazione della proteina DnaA è importante affinché avvenga la replicazione.

Terminazione della replicazione

L’ori di un genoma batterico si trova a circa 15’ mappa, al 1’ si trova il primo aa che è stato trasdotto nel Coli (thr), le due forche si incontrano non al polo opposto ma è un po’ più spostato ed esiste un meccanismo di regolazione in regioni ter in cui si legano due proteine Tus (E.Coli) e RPT (B.Subtilis) che interrompono il procedere della forca interagendo probabilmente con l’elicasi, esistono almeno 6 siti ter e funzionano in modo unidirezionale, è un monomero che si lega o in un modo o nell’altro in base alla disposizione della sequenza ter, sono sequenze altamente analoghe e non sono palindromiche.

Nel Coli le due forche replicative si incontrano nella regione compresa tra terC e terA nel 99% dei casi, nell’1% terC viene oltrepassata e si incontrano in terB, a ridosso del punto opposto all’ori, una volta che si arriva a questa sequenza il replisoma si blocca, gli altri ter vengono oltrepassati in quanto non presentano la sequenza direzionalmente corretta.

L’elicasi è costituita da 6 subunità con siti ATPasici ed esiste un’asimmetria nelle subunità e si susseguono i seguenti stati: ATP, ADP, vuota, ogni subunità vuota ha davanti a sé una subunità con ATP e anche le altre allo stesso modo, ad ogni ciclo le subunità cambiano lo stato in maniera sistematica e questo cambiamento di stato asimmetrico provoca un meccanismo ballerino che permette la denaturazione del DNA e la scomposizione delle due eliche.

Tus agisce inibendo l’azione di ciascuna subunità una alla volta provocando un’alterazione della funzione sempre maggiore finché l’elicasi non smette di funzionare.

Cromosomi lineari e replicazione

Cromosomi lineari li hanno Borrelia, streptomyces, rhodococcus fascians e agrobacterium tumefaciens (che modifica lo stato della pianta grazie all’iniezione del DNA nella pianta ed è stato motivo di numerosi esperimenti di ingegneria genetica vegetale), i procarioti non hanno le telomerasi e utilizzano diversi meccanismi ipotizzati:

• Nella parte terminale sono presenti sequenze palindromiche che ripiegano la terminazione e in questo modo la DNAP ricopre il frammento di Okazaki, in seguito una nucleasi taglia il ripiegamento offrendo al di sotto un 3’OH e la DNAP ricopre anche quel frammento.
• Prevede una struttura a doppio ripiegamento e si ha una collaborazione tra DNAP e nucleasi.
• Una proteina ad RNA che si lega a una sequenza specifica e fornisce il primer alla polimerasi.

Il replisoma si ancora alla regione centrale della cellula mentre i cromosomi neosintetizzati migrano alle estremità polari con l’origine di replicazione e l’ultima regione a essere replicata è la sequenza ter, si pensava che l’allungamento fosse dato dall’ori, ancorata alla membrana, che veniva trascinata ai due poli in proporzione alla replicazione del nucleoide, in realtà non è vero in quanto il nucleoide si replica molto più velocemente di quanto la membrana si sintetizza, la ghigliottina data dal setto dei mutanti delle cellule cade nei siti ter, locus