Microbiologia delle fermentazioni

Microbiologia dei processi fermentativi

Cenni sulla morfologia

I batteri sono i microorganismi più piccoli; la dimensione dei microorganismi incide su tempi di replicazione, adattabilità e cinetiche di fermentazioni; le cinetiche di fermentazione che usano i batteri sono più veloci; l’ordine di grandezza dei batteri è 1 micrometro, negli eucarioti è 100 micrometri; i batteri possono avere diverse forme e dimensioni; possono esserci cocci, pneumococchi, streptomiceti, actinomiceti.

Al microscopio elettronico si possono distinguere funghi, lieviti, batteri actinomiceti. Se si vede una struttura spessa con ramificazione, piccoli pallini sono lieviti, pallini più grandi sono batteri, altrimenti sono actinomiceti.

Il microorganismo più piccolo ha una superficie di scambio maggiore, e può scambiare meglio elementi nutritivi e di scarto con l’ambiente.

Processo fermentativo e morfologia

All’interno di un fermentatore, le colture possono essere sommerse o solide.

Nelle colture solide, il substrato nutritivo è solido, nelle colture sommerse, il substrato nutritivo è disciolto in soluzione; la forma del microorganismo è importante per allestire una fermentazione con coltura sommersa.

Nel mezzo acquoso sono presenti il microorganismo e i nutrienti; il microorganismo deve assumere i nutrienti dal brodo colturale per crescere nel fermentatore. I nutrienti sono carbonio, azoto, fosforo e ossigeno; il terreno di coltura si prepara con preparati in polvere che contengono tutti i nutrienti, oppure aggiungendo ogni componente separatamente; successivamente si sterilizza con calore.

Nelle fermentazioni aerobiche, l’ossigeno è un nutriente presente in modo massivo; l’ossigeno è insufflato dall’esterno con componenti specifici del fermentatore (insufflato = mettere aria in un corpo elastico. In medicina, introdurre nel corpo umano un gas o un vapore).

I nutrienti sono omogenei, ma l’ossigeno non è normalmente omogeneo; l’ossigeno non è gassoso, ma quello che riesce ad essere disciolto nel liquido; inoltre, l’organismo produce gas esausti come CO2 che devono essere dispersi per assicurare la continuità della crescita.

La biomassa nel fermentatore cresce in modo diverso a seconda della sua tipologia; nei funghi il terreno liquido diventa pastoso.

La morfologia influenza lo stirring (mescolare), l’agitazione meccanica che impedisce ai soluti di precipitare; a seconda della morfologia dell’organismo, cambia il consumo di energia, la velocità che deve essere impressa alle eliche del fermentatore, la forma delle eliche.

La morfologia interessa l’area e l’areazione; bisogna immettere aria come delle bolle, che vengono rotte dal sistema di agitazione; in seguito, alla rottura delle bolle, l’ossigeno diffonde più facilmente in un terreno liquido rispetto ad un terreno pastoso.

La morfologia interessa il mass transfer, il trasferimento di massa, costituito da nutrienti, sostanze tossiche rilasciate; inoltre influenza l’andamento della fermentazione; il microorganismo produce acidi organici o CO2, modificando il pH; le sonde misurano il pH e diverse pompe immettono un tampone per mantenerlo costante; il tampone si disperde più facilmente in un terreno liquido che in un terreno pastoso; in un terreno pastoso, la capacità tamponante è minore; la predisposizione del fermentatore deve risolvere eventuali shock termici, di pH, di nutrienti.

Funghi

I funghi sono organismi eucariotici che comprendono i lieviti unicellulari e i funghi filamentosi pluricellulari, dove più ife (con il termine ife si indicano i filamenti unicellulari o pluricellulari, uninucleati o polinucleati di forma cilindrica allungati, che disposti uno sull'altro formano il micelio, ovvero il corpo vegetativo dei funghi) formano un micelio; alcuni funghi particolari sono detti dimorfici, e presentano la forma yeast-like (lievito simile) e filamentosa allo stesso tempo.

Bisogna riconoscere i funghi dimorfici rispetto ai soli lieviti o i soli funghi filamentosi, altrimenti si può pensare erroneamente che il campione sia contaminato da una delle due forme; al variare delle concentrazioni di determinate sostanze, i funghi dimorfici possono assumere una delle due forme; la torbidità è una caratteristica dei lieviti.

Dal punto di vista fermentativo, la presenza di funghi dimorfici necessita di accortezze; la variazione della concentrazione di determinate sostanze può stressare il fungo, ma anche gli stress meccanici possono causare lo shift tra forma yeast-like e filamentosa.

Morfologia dei funghi filamentosi

I funghi filamentosi influenzano la tipologia di brodo colturale e sulla dispersione dell’ossigeno; a seconda del fungo e del regime di agitazione, i miceli possono avere più forme; come il micelio disperso: nel micelio disperso si notano solo ife e ramificazioni; il terreno si presenta come un liquido pastoso, con la consistenza di uno yogurt; il micelio disperso può formare aggregati lassi chiamati clumps; i clumps sono la forma intermedia tra miceli dispersi e pellets.

I pellet sono aggregati sferici e compatti dei miceli dovuti al movimento rotatorio delle eliche; il micelio disperso presenta tutte le cellule attive, e il trasferimento di massa è massimo; tuttavia, nel fermentatore, si crea una viscosità molto alta, e le bolle d’aria entrano in un terreno viscoso; i liquidi viscosi, pastosi, sono non newtoniani.

Nel pellet, la zona esterna è attiva rispetto all’interno, però il brodo si mantiene più liquido e favorisce la dispersione di nutrienti, scarti e ossigeno; la struttura del pellet diventa più compatta all’aumentare del tempo; i liquidi più fluidi sono newtoniani; più forza si applica al brodo, più questo gira; all’interno del pellet, l’accumulo di sostanze tossiche può portare all’autolisi cellulare.

Scelta del microorganismo e del substrato

Il microorganismo utilizzato in un processo industriale viene scelto secondo determinati criteri; il processo fermentativo è caratterizzato dalla conversione del substrato in prodotto, operata dal microorganismo nel fermentatore; il processo a monte della fermentazione è detto upstream process; la scelta del microorganismo e del terreno sono due componenti fondamentali del processo di upstream.

Il microorganismo può essere isolato dall’ambiente o prelevato da una collezione microbica; se il microorganismo proviene dalla collezione microbica è in coltura pura, è caratterizzato dal punto di vista genico e dal punto di vista nutrizionale; se il microorganismo proviene dall’ambiente, è possibile scoprire nuove applicazioni dello stesso o nuovi prodotti metabolici, ma prima deve essere identificato dal punto di vista morfologico, studiato, isolato in coltura pura.

I microorganismi sono ubiquitari, e possono essere cercati casualmente nell’ambiente; prelevando vari organismi, posso attuare un successivo screening per identificare i microrganismi di interesse; altrimenti, posso individuare un microorganismo specifico per le mie esigenze.

Caratteristiche di un microorganismo industriale

• Un microorganismo deve essere caratterizzato da stabilità genetica; ogni volta che inserisco un microorganismo nel fermentatore, questo si duplica per N volte, e se è geneticamente instabile, per ogni evento di replicazione il tasso di mutazione è alto; se è instabile, anche se è un buon produttore, il prodotto varia nel tempo; il prodotto target deve essere prodotto in modo efficiente; deve produrre grandi quantità di prodotto desiderato, e un numero limitato di prodotti secondari indesiderati.
• Inoltre, la produzione deve essere veloce, perché il tempo di produzione è inversamente proporzionale ai costi.
• Il microorganismo deve avere una limitata richiesta di fattori di crescita e vitamine, che sono costosi e difficili da utilizzare per la preparazione della fermentazione.
• Il microorganismo deve utilizzare il maggior numero di substrati a basso costo; più i substrati sono economici, più la durata del processo è sostenibile dal punto di vista dei costi.
• Il microorganismo deve essere facilmente manipolabile dal punto di vista genetico; in tal modo, dalla coltura di laboratorio fino al fermentatore industriale, la capacità del microorganismo può essere migliorata; con la manipolazione genica, dalla scoperta della penicillina fino ad oggi, l’incremento di efficienza della produzione è stato del 300%; il miglioramento genetico è detto strain improvement.

Lo strain improvement permette di eliminare prodotti secondari dalla produzione, utilizzare substrati più economici, aumentare la produttività, modificare il prodotto ottenuto per ottenere nuove soluzioni (come gli antibiotici), decifrare i pathway (pathway = via metabolica) biosintetici; alcuni geni possono essere silenziati per studiare le variazioni nel pathway metabolico; conoscere il pathway metabolico permette di evitare repressioni da catabolita.

La sicurezza del microorganismo è importante; il microorganismo non deve essere patogeno; un organismo sicuro viene definito GRAS (i batteri lattici sono considerati organismi di grado alimentare e la maggior parte di essi sono riconosciuti come generalmente sicuri per la salute umana, cioè organismi GRAS).

Il microorganismo deve essere facilmente rimovibile dal brodo di coltura, deve flocculare, sedimentare o creare schiuma; il prodotto rilasciato nel brodo deve essere facilmente recuperabile.

Se il prodotto è intracellulare, il microorganismo deve essere facilmente lisabile per ottenere il prodotto; l’accumulo di prodotto nel brodo strutturale può inibire a feedback la via metabolica; la manipolazione genetica strain improvement permette di evitare repressioni a feedback; alcune volte, il prodotto è tossico per il microorganismo stesso, quindi selezionare microorganismi che tollerano alte concentrazioni di prodotto sono favoriti.

Durante le produzioni eterologhe, quando un microorganismo ingegnerizzato viene utilizzato per produrre sostanze (che normalmente non produce), bisogna evitare che il prodotto possa avere effetti tossici.

Miglioramento genetico

Ci sono due diversi approcci per migliorare geneticamente un microorganismo: approccio classico, random o per mutagenesi; approccio con mutazione intenzionale.

Il tasso di mutazione spontaneo può essere aumentato esponendo il microorganismo a mutageni chimici e fisici; i mutageni chimici possono essere analoghi delle basi (aggiunti erroneamente nella replicazione e letti erroneamente in seguito) o agenti intercalanti (sostanze planari che si intercalano nella doppia elica e creano scivolamenti nel quadro di lettura); un agente fisico è dato dai raggi UV; analoghi delle basi, agenti intercalanti, raggi UV, aumentano solo il tasso di mutazione, ma non garantiscono la generazione di mutanti vitali o mutanti vantaggiosi.

A valle della mutagenesi, i mutanti devono essere sottoposti ad un processo di screening, per verificare se si è ottenuto l’effetto desiderato; la chance di trovare un mutante alto produttore è direttamente proporzionale al numero di mutanti utilizzati; generalmente, le collezioni microbiche giocano un ruolo fondamentale nella conservazione dei microorganismi.

Oltre al congelamento a -80°C, l’aggiunta di agenti crioprotettivi permette di evitare i danni alla cellula dovuti alla formazione dei cristalli di ghiaccio; con questa pratica aumento il tasso di sopravvivenza; il tasso di sopravvivenza varia da microorganismo a microorganismo.

Il microorganismo può essere anche liofilizzato; la liofilizzazione è una rimozione dell’acqua per sublimazione; ovvero dallo stato solido (ottenuto congelando), allo stato gassoso; si ottiene a basse temperature, basse pressioni e sottovuoto.

Un microorganismo è geneticamente stabile quando la sua frequenza di mutazione spontanea è bassa; una mutazione può essere vantaggiosa, svantaggiosa o neutrale nei confronti della mutazione; se la mutazione incide sulla capacità produttiva in modo positivo, essa deve essere conservata congelando la colonia madre; altrimenti, le ulteriori mutazioni possono portare alla perdita di caratteristiche vantaggiose dal punto di vista industriale; l’effetto della mutazione sul processo produttivo dipende dalla fase del processo in cui si verifica; ha meno peso se avviene durante la fase di scale up, specialmente se è una mutazione svantaggiosa.

Esistono dei metodi automatizzati che consentono di effettuare la mutagenesi (con UV) e il successivo screening; questi sistemi compiono la semina e i passaggi tra diversi terreni colturali in un ambiente grande e sterile; l’automatizzazione aumenta la chance di successo.

Microbiologia dei processi fermentativi

Il fermentatore è uno strumento ottimale all'interno del quale si allestisce la trasformazione del substrato in prodotti. È costituito da un contenitore nel quale immettiamo una coltura pura per cui si mantiene un ambiente sterile. Le prestazioni dipendono da fattori fisici e chimici chiave che devono essere controllati; questi sono la temperatura, il pH, l'ossigeno, la produzione di schiuma e l'agitazione.

Un fermentatore:

• Deve lavorare in modo asettico per evitare contaminazioni della coltura e fuoriuscite. Il contaminante può mangiare il substrato per il nostro microrganismo oppure formare la schiuma e altri metaboliti che intralciano la purificazione.
• Deve avere una adeguata agitazione ed areazione.
• Deve dare un limitato consumo energetico siccome le fermentazioni possono durare settimane o giorni.
• Deve garantire un controllo e misura di temperatura pH: ci sono delle sonde che si trovano all'interno del fermentatore per controllare il pH.
• Si deve avere la possibilità di prelevare il campione in sterilità senza contaminazione.
• Si deve evitare le perdite di evaporazione perché comunque si lavora a 30°, c'è agitazione ed ossigeno immesso.
• Il contenitore deve essere costituito con un materiale che può essere vetro o acciaio, che forma superfici lisce per i microrganismi che ne aderiscono ad esse.

Le fermentazioni si possono dividere in due grandi categorie:

• Strato sommerso: è una fermentazione in cui il terreno è il liquido nel quale sono contenuti nutrienti per le cellule ed è ad alto costo. Utilizzano strato liquido come le melasse. La degradazione del substrato è molto veloce per questo si pensa ad una immissione del substrato. Ci vogliono ore per la fermentazione. Il sistema coinvolge due fasi: fase liquida dove sono dispersi gli alimenti e fase gassosa ovvero la fase attraverso cui forniamo ossigeno. La quantità di inoculo è piccola. L'agitazione è essenziale.
• Strato solido: il microrganismo utilizza una superficie solida; è applicata a funghi filamentosi in quanto crescono a ife. Non c'è acqua ma un'alta umidità ed è a basso costo. In questo caso si utilizzano strati solidi come cereali non troppo spessi per facilitare gli scambi gassosi. Il tempo di degradazione del substrato avviene lentamente senza immissione del substrato. Ci vogliono settimane per la fermentazione e sono ottimali per i funghi che non richiedono acqua liquida. Per sistema coinvolge tre fasi: fase solida coinvolto il substrato, fase liquida c'è un film di acqua, fase gassosa ovvero produzione di anidride carbonica che deve essere allontanata dal sistema. La quantità di inoculo deve essere molto grande perché si deve coprire le zone del fermentatore e per la velocità di metabolizzazione dell’inoculo. Può prevedere l'agitazione ma non è essenziale.

I tipi di bioreattori che si utilizzano nello strato sommerso sono: il bioreattore con agitazione meccanica, reattori con agitazione pneumatica in cui l'aria agita il sistema o reattori a colonna di bolle. Nello strato solido il tipico reattore è il bioreattore a vassoi, reattori a letto impaccato, reattori a tamburo rotante, reattori agitati e areati.

Bioreattori a strato sommerso

Questi bioreattori sono composti da:

• Un volume di lavoro: è lo spazio riempito con il brodo culturale. Rappresenta il 70 80% ma dipende dalla strategia fermentativa (come la coltura batch).
• Spazio di testa: è la parte rimanente. Viene aumentato quando si produce tanta schiuma. La schiuma dipende dalla composizione del terreno velocità di agitazione ossigeno stato vitale delle cellule. Per esempio, quando le cellule lisano producono schiuma. La schiuma è fastidiosa per gli scambi gassosi, per una questione meccanica che va ad ostruire il filtro di uscita dei gas esausti, inoltre c'è un problema di contaminazione.

Nomenclatura:

• Vessel: contenitore di fermentazione. I vessel possono essere a parete singola o a doppia (si parla in questo caso di camicia); sopra al vessel c’è una piastra su cui alloggiano vari elementi.

Nel bioreattore ad agitazione meccanica si ha:

• Motore.
• Asse su cui ci sono delle pale.
• Frangivortici.
• Sparger.
• Filtri di aria.
• Condensatore (uscita gas esausti).
• Porta inoculo.
• Tubo per fare il prelievo immerso nel terreno.
• Vari elettrodi (sonde) per il pH, temperatura, schiuma.
• Dito raffreddante.
• Guaina che riscalda.
• Bottiglie di acidi e basi.
• Uscita a 3 vie.
• Bottiglia per fare il vuoto (preleva il campione e fa il vuoto per aspirare).
• Sistema elettronico in cui gli elettrodi misurano i valori.

Microbiologia dei processi fermentativi

Nel momento in cui si deve allestire la fermentazione quest’ultima deve essere sterilizzata. E la sterilizzazione avviene in situ ovvero direttamente nel reattore che consente la sterilizzazione degli strumenti interno al reattore che del brodo colturale.

La temperatura: il microrganismo utilizzato ha bisogno di una temperatura ottimale e inoltre c’è da tenere conto che durante le reazioni viene rilasciato calore. Nel caso di fermentatori