Microbiologia

Microbiologia

Microbiologia: scienza che studia i microbi, scienza dell’invisibile, organismi invisibili a occhio nudo ma aventi grande impatto su ciò che li circonda. È una scienza giovane perché necessitava di attrezzatura tecnologica avanzata per vedere i microbi, si sospettava della loro esistenza, ma non si poteva dimostrare. Questi microbi venivano chiamati “animacula”.

Storia delle scoperte microbiologiche

1676 Antoine Van Leeuvenhoek, mercante di stoffe olandese con la passione per le lenti, costruì un microscopio rudimentale che ingrandiva circa 300 volte, questa fu la prima dimostrazione dell’esistenza dei microbi. Egli iniziò a osservare i materiali più disparati, la prima osservazione fu quella della placca batterica, patina giallastra raschiata dai denti, questa è una comunità batterica molto ricca. In questa osservò dei microrganismi che disegnò (rese note le sue ricerche alla “Royal Society” di Londra), ma le sue scoperte rimasero a lungo isolate e non confermate perché non si riusciva a fabbricare lenti potenti come le sue. La scoperta dei microrganismi rafforzò l’idea, già presente, che questi fossero responsabili delle malattie dette contagiose. Ci vollero più di 200 anni (metà dell’800) per capire che potessero essere agenti di malattie.

Grande impulso fu dato da Robert Koch (1843-910):

• 1878: Prima dimostrazione diretta che i microrganismi sono agenti di malattie, egli dimostrò l’agente eziologico del carbonchio (Bacillus anthracis), che colpiva il bestiame.
• 1882: Isolò l’agente eziologico della tubercolosi (Mycrobacterius tuberculosis).
• 1888: Isolò il vibrione del colera (Vibrio cholerae) identificato nell’acqua contaminata.
• 1905: Vinse il premio Nobel per la medicina.

In circa 25 anni furono scoperti i principali agenti batterici di malattie dell’uomo e furono messi a punto metodi di prevenzione con l’immunizzazione artificiale (vaccino) e l’applicazione di misure igieniche. Verso la metà del ‘900, furono introdotti i primi antibiotici (1940, penicillina, scoperta da Alexander Fleming nel 1928).

Dall’inizio del secolo scorso le morti per malattie infettive sono andate progressivamente diminuendo grazie all’introduzione di vaccini e antibiotici. Le malattie infettive nonostante tutto sono odiernamente la seconda causa di morte su scala globale, 6 di queste sono quelle principali: malattie respiratorie (influenza, polmonite…), AIDS, diarrea, tubercolosi, malaria, malattie dell’infanzia (morbillo, tetano, pertosse…). Nei paesi sviluppati le maggiori cause di morte sono principalmente malattie non trasmissibili, come il cancro, mentre in quelli in via di sviluppo sono rimaste presenti quelle infettive.

La possibilità che insorgano nuovi agenti eziologici infettivi è sempre presente:

• 2003: SARS-CoV severe acute respiratory syndrome;
• 2009: H1N1, Influenza suina (pandemia);
• 2014: Ebola virus (epidemia);
• 2019-oggi: SARS-CoV-2 (pandemia).

Classificazione dei microrganismi

I microrganismi sono un gruppo molto eterogeneo di organismi viventi comprendenti alcuni metazoi, protozoi, alcune alghe, funghi, batteri e virus. Generalmente sono unicellulari, ma talvolta possono aggregarsi tra loro a formare aggregati pluricellulari in cui tutte le cellule sono equivalenti e, occasionalmente, possono presentare cellule, o gruppi di cellule, con caratteristiche morfologiche e funzionali differenziate.

Organizzazione cellulare

Differenza tra procarioti e eucarioti

Ci sono due principali differenze: i procarioti non presentano una membrana nucleare, non c’è una compartimentizzazione del citoplasma, ovvero non si hanno organelli complessi, né sistema di membrane interne presenti, invece, negli eucarioti. Altre differenze riguardano le dimensioni, maggiori nella cellula eucariotica…

I batteri

Procarioti. Classificazione in base ai criteri morfologici:

• Forma: importante perché, come molti altri caratteri, è un carattere tassonomico, ovvero, sempre costante in una specie.
  • Cocchi:
    • Sferici: la maggior parte.
    • Reniformi (o a fagiolo): neisserie.
    • A punta di lancia: pneumococchi.
    • A virgola: vibrioni.
  • Bastoncelli:
    • Dritti e regolari: bacilli.
    • A spirale: spirilli.
    • Filamentosi.

Diagnosi eziologica: diagnosi che mi dà indicazioni sulla malattia da cui sono affetta.

• Disposizione: come si pone rispetto alle cellule sorelle.
  • A coppie: diplococchi.
  • A catene più o meno lunghe: streptococchi.
  • Irregolare: stafilococchi (grappoli).
  • Tetradi: quattro cellule.
  • Sarcine: otto cellule a cubo.

Cocchi: Organizzazione in funzione del piano di divisione cellulare

La disposizione è caratterizzata dalla divisione cellulare, se questa avviene:

• Secondo un solo asse ho:
  • Diplococchi: cellule unite a due a due.
  • Stafilococchi: le cellule figlie rimangono unite ed a loro volta si dividono secondo piani tra loro paralleli e perpendicolari al piano di allungamento della catena di cellule.
• Se avviene secondo assi casuali irregolari disposti in tutte le dimensioni dello spazio ho la formazione degli stafilococchi: ammassi irregolari di cellule.

Caratteri tintoriali

La colorazione più diffusa è la colorazione di Gram, introdotta da Hans Christian Joachim Gram (1853-1938). Si dispongono i batteri in uno strato sottile su un vetrino, si fanno asciugare e si attua un fissaggio al calore, passandoli velocemente sulla fiamma di un becco, questo evita che il colorante rimuova i batteri dal vetrino.

• Colorazione primaria: si ricopre completamente il vetrino di cristalvioletto, colorante basico viola che si lega alla superficie cellulare caricata negativamente nei batteri. Tutti i batteri sono viola.
• Mordente: fissaggio del colore, si ricopre il preparato con una soluzione di ioduro di potassio e di iodio che si complessa con cristalvioletto e materiale cellulare.
• Decolorazione: aggiungo gocce di etanolo, in questa fase noto un comportamento diverso, alcuni mantengono il colorante, altri perdono la colorazione primaria divenendo incolori.
• Colorazione di contrasto: tratto con safarina, colorante rosso, che dà colorazione ai GRAM-.

Su questa base i batteri si dividono in:

• GRAM+: mantengono il colorante.
• GRAM-: perdono il clorante.

Questi caratteri (morfologia, disposizione e caratteristiche tintoriali) possono essere visti solo con microscopio ottico dopo aver eseguito una colorazione di Gram. Ad occhio nudo posso vedere le colonie batteriche, risultato della divisione di una cellula batterica. Contengono milioni di cellule batteriche. Possono essere osservate ad occhio nudo sulla superficie di terreni di coltura solidi, ovvero mezzi artificiali che contengono vari nutrienti in grado di sostenere la crescita dei batteri. Anche la forma e la morfologia delle colonie costituiscono dei caratteri tassonomici:

Nome batteri

In latino, costituito da due nomi, spesso questo conferisce informazioni. Per esempio “Streptococcus pneumoniae (polmonite)”, “Staphylococcus aureus (colore giallastro)”. Colonie Mycrobacterium tuberculosis: colonia a cavolfiore.

Classificazione in base ai caratteri metabolici e biochimici

Sono caratteri più obiettivi rispetto a quelli tassonomici, non dipendono da chi li osserva. La classificazione permette di identificare una specie batterica o varianti all’interno di essa (biotipi) tramite l’analisi del “profilo” biochimico.

• Necessità o meno dell’ossigeno per la crescita (aerobi/anaerobi);
• Utilizzazione di alcuni zuccheri come unica fonte di carbonio;
• Produzione di certi substrati;
• Utilizzazione del citrato;
• Produzione di certi enzimi;
• Decarbossilazione di alcuni aminoacidi.

Questi caratteri vengono rilevati attraverso dei kit commerciali che permettono di eseguire contemporaneamente sullo stesso isolato clinico più di venti test biochimici miniaturizzati. Sono costituiti da pozzetti in cui si ha del substrato e a seguito dell’incubazione a seconda del colore del pozzetto si avrà un determinato profilo biochimico, se ho un risultato positivo avrò + altrimenti -. Questi risultati vengono confrontati con un database computerizzato per ottenere l’identificazione del microorganismo.

Si può identificare un batterio secondo semplici chiavi tassonomiche: Escherichia coli Staphylococcus aureus.

Classificazione sulla base dei caratteri sierologici

Permette di identificare delle specie, o delle varianti all’interno di essa (sierotipi/sierogruppi), sulla base degli antigeni:

• Molecole di superficie riconosciute come estranee dall’organismo umano, o animale, e sulla base delle quale il sistema immunitario produce anticorpi.

Molti batteri esistono in natura come varianti antigeniche multiple (es. Meningite gruppo A, B e C), questo è un vantaggio selettivo per la sopravvivenza del batterio (altrimenti la popolazione si immunizzerebbe).

Classificazione sulla base dei caratteri genetici

È il metodo più accurato di identificazione di una specie, analizza una serie di caratteri genetici tra cui:

• Percentuale di guanina e citosina;
• Percentuale di ibridazione del DNA;
• Analisi dei plasmidi;
• Analisi delle sequenze codificanti per l’RNA ribosomiale;
• Analisi di frammenti di DNA cromosomico generati con enzimi di restrizione;
• Analisi della sequenza nucleotidica di particolari regioni genetiche;
• Sequenziamento dell’intero genoma.

Conoscere la sequenza delle basi azotate. Nel 1995 sono state ottenute le prime sequenze complete del genoma di 2 specie batteriche: Haemophilus influenzae e Mycoplasma genitalium. Permette di identificare i geni delle proprietà patogene. Fornisce una grande quantità di informazioni grazie all’analisi comparativa delle sequenze. Da allora sono stati sequenziati e pubblicati più di 300 genomi batterici appartenenti per lo più a batteri patogeni, ma anche a normali saprofiti ambientali. Circa 940 genomi batterici sono al momento in corso di sequenziamento.

Nomenclatura batteri

• In Latino;
• Si scrive in corsivo;
• Binomiale: Fu inventata da Linneo nel “Sistema Naturae”.
• Esempio: Treponema pallidum (sifilide).

Struttura generalizzata di una cellula batterica

Unicellulare.

Il citoplasma batterico

Massa semifluida racchiusa dalla membrana citoplasmatica. È costituito da una soluzione acquosa in cui sono presenti tutti gli elementi che assicurano il metabolismo cellulare:

• Proteine;
• Metaboliti intermedi;
• Enzimi;
• Ribosomi (fino a 20.000 in E.coli);
  • Due subunità, costituiti da RNA (65%) e proteine (35%), si associano in catene chiamate polisomi.
• Assenza di mitocondri, apparato del Golgi, reticolo endoplasmatico, lisosomi etc.
• Presenza di inclusioni citoplasmatiche (granuli) contenenti sostanze di riserva.

Materiale genetico

Non è racchiuso da una membrana nucleare come nelle cellule eucariotiche, ma è libero nel citoplasma; È aploide (1 copia di ciascun gene), costituito da un unico cromosoma = molecola di DNA circolare a doppio filamento; Ha notevoli dimensioni (c.a.1 mm da steso) strettamente avvoltolato a formare un nucleoide da cui sono esclusi i componenti citoplasmatici; associato a poliammine e a proteine basiche simil-istoniche. Una piccola % di DNA (1-2%) ha localizzazione extracromosomica e va a costituire, nel citoplasma, piccole unità circolari di DNA chiamate plasmidi. I plasmidi possono moltiplicarsi indipendentemente dalla normale divisione della cellula ospite e trasportano informazione genetiche non indispensabili alla vita del batterio, ma che possono essere importanti per la sua patogenicità.

Tra i caratteri legati a geni plasmidici sono da ricordare:

• La resistenza agli antibiotici;
• La produzione di alcune tossine;
• La produzione di battericine (proteine ad attività antibatterica, importanti nei fenomeni di competizione tra batteri).

Membrana citoplasmatica

È morfologicamente simile a quella delle cellule eucariotiche, racchiude il citoplasma batterico. È strutturata secondo il modello a mosaico fluido (doppio strato fosfolipidico) ed è composta da:

• Fosfolipidi:
  • Molecole amfipatiche che in ambiente acquoso si organizzano a formare un doppio strato (in E. coli sono stati identificati 7 tipi di fosfolipidi; uno dei più comuni è rappresentato dalla fosfatidilserina).
• Proteine:
  • Periferiche: blandamente associate alla membrana;
  • Integrali: le più abbondanti -70%-, attraversano tutto lo strato idrofobico; circa 200 proteine nella membrana di E. coli).
• Carboidrati:
  • In piccola quantità sotto forma di glicoproteine o glicolipidi.
• Non contiene steroli (che rendono la membrana rigida): Tranne che nei micoplasmi.

Funzioni della membrana

• Barriera selettiva e di trasporto di soluti dentro e fuori dalla cellula: È responsabile della ritenzione del contenuto intracellulare e del controllo dello scambio dei metaboliti. La disposizione del doppio strato lipidico rende la membrana impermeabile agli ioni e alla maggior parte delle molecole polari (idrofiliche) ed anche a quelle non polari (idrofobiche) con un peso molecolare superiore ad un certo valore a meno che non esistano sistemi di trasporto specifico.
• Funzione biosintetica: Nella membrana sono localizzati gli enzimi che sintetizzano i precursori polisaccaridici della parete cellulare, così come i trasportatori lipidici su cui vengono riunite le sottounità della parete cellulare.
• Trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa nelle specie aerobie: (produzione energia) I citocromi e gli altri enzimi della catena respiratoria sono situati nella membrana citoplasmatica, che risulta analoga funzionalmente alla membrana interna dei mitocondri delle cellule eucariotiche.
• Interviene nel processo di duplicazione del DNA: Contiene gli enzimi necessari alla duplicazione del DNA e lo tiene ancorato al fuso primitivo.

La membrana spesso si invagina all’interno del citoplasma a formare mesosomi, che possono essere anche molto voluminosi. Essi sono invaginazioni della membrana citoplasmatica di notevoli dimensioni, di forma irregolare, spesso circonvoluta, abbondanti e voluminosi soprattutto nei batteri Gram+. Svolgono molte delle funzioni della membrana citoplasmatica:

• Mesosomi settali: intervengono nella divisione cellulare e tengono legato il DNA facilitando la separazione dei 2 cromosomi e la produzione del setto trasverso.
• Mesosomi respiratori: contengono la maggior parte dei citocromi e degli enzimi respiratori.
• Mesosomi biosintetici: contengono enzimi che intervengono nella sintesi dei componenti della parete.

Parete batterica

Involucro posto all’esterno della membrana citoplasmatica in quasi tutti i batteri (ad eccezione dei micoplasmi). Spessore variabile, costituenti peculiari, alcuni dei quali presenti solo nei batteri.

Funzioni della parete batterica

• Protezione dai danni di tipo osmotico (la più importante): se una cellula viene posta in un ambiente acquoso, a causa della quantità di costituenti del citoplasma (il quale è ipertonico rispetto all’esterno) l’acqua inizierà a penetrare. Se non vi fosse la membrana la cellula scoppierebbe. Alcuni antibiotici, come la penicillina, inibiscono la formazione della parete batterica.
• Mantenere la forma del batterio;
• Protegge dalle offese meccaniche;
• Funzione immunitaria;

Composizione chimica della parete batterica

Il principale costituente è il peptidoglicano (o mureina, nome che fa riferimento alla funzione = muro), grande molecola costituita da peptidi (piccola sequenza di amminoacidi, legano trasversalmente le catene e sono legati tra loro da legami covalenti) e glucidi (lunghe catene lineari disaccaridiche concentriche alla cellula batterica), responsabile della rigidità della parete.

La parete batterica è diversa nei GRAM+, rispetto ai GRAM-:

• Acidi teicoici e lipoteicoici: Di natura lipidica solubile in alcool. I GRAM+, quindi, trattengono il colore grazie allo spesso strato di peptidoglicano mentre, i GRAM-, non lo trattengono a causa dello strato sottile e della membrana solubile in alcool.

Struttura del peptidoglicano

• Componente glucidica: Catena lineare di n unità di un disaccaride costituito da:
  • N-acetil-D-glucosammina (NAG)
  • Acido N-acetil-muramico (NAM)

Che si alternano linearmente. Entrambe hanno la stessa struttura (a 6 atomi di C, comune in natura), ad eccezione di un acido lattico legato mediante ponte ad ossigeno al C3 del NAM.

Legame β-1,4-glicosidico = covalente forte. Il lisozima è presente nei nostri fluidi e va a idrolizzare il legame che unisce il NAG al NAM, indebolendo la parete batterica, fa quindi parte del sistema di difesa innato dell’organismo.

• Componente peptidica: (corte catene)
  • Catena di aminoacidi (tetratpeptide) alternati negli stereoisomeri D e L. Il gruppo carbossilico del gruppo lattilico del NAM si lega al gruppo aminico del primo a.a. del tetratpeptide mediante un legame carboaminico.

La sequenza di a.a. nei tetratpeptidi può variare da una specie batterica all’altra, ma contiene sempre in terza posizione un a.a. bibasico che è in genere la lisina (nei Gram+) o l’acido diaminopimelico (nei Gram-). I tetratpeptidi legati al NAM si legano tra di loro.