Microbiologia

Cerrutti 2 anno 1 semestre

Introduzione

La microbiologia è lo studio dei microrganismi intesi come esseri viventi invisibili ad occhio nudo che di solito sono unicellulari o acellulari (virus) con misure minori di 0,1 mm.

10^-10 (1 A° = 1 Armstrong = m)

Studia inoltre le loro attività, ha come oggetto:

• La morfologia;
• La struttura;
• La riproduzione;
• La fisiologia;
• Il metabolismo;
• L'identificazione;
• La distribuzione in natura;
• La relazione tra loro e tra altre specie;

• Gli effetti che hanno;
• Le modifiche che provocano nell'ambiente, caratteristica sfruttata dall'uomo (i metano-produttori sono usati per produrre metano e vengono sfruttati alcuni microrganismi per la fermentazione dell'uva trasformandola in vino).

Microscopio ottico Batteri Microscopio elettronico Virus

Microrganismi

• Batteri
• Alghe
• Virus
• Protozoi
• Funghi
• Lieviti unicellulari

Non si originano spontaneamente da materia inanimata ma derivano sempre da altri organismi.

Procariote (Batteri), hanno minore complessità, il DNA disperso nel citoplasma, è addensato in una regione della cellula = NUCLEOIDE = REGIONE NUCLEARE, solo i ribosomi ma più piccoli per la sintesi delle proteine, un'unica membrana citoplasmatica fosfoglicoproteica.

Eucariote (Protozoi, lieviti, alghe, piante superiori e animali), hanno un nucleo delimitato, diversi organelli e complessi di membrane.

Tipi di cellule

I microrganismi in natura sono:

• Causa di malattie;
• Causa di degradazione alimentare;
• Essenziali per la vita, perché possono svolgere funzioni importanti, nei ruminanti per esempio sono presenti alcuni batteri nel rumine e nell'intestino degli erbivori che permettono la digestione della cellulosa;
• Necessari per i cicli geochimici, come gli azotofissatori, e la fertilizzazione del suolo;
• Utilizzati come biomassa e nella produzione di farmaci.

Molte malattie sono causate da infezioni virali, batteriche, fungine e protozoarie, i postulati di Koch vengono utilizzati per determinare il legame tra una malattia e il microrganismo che si sospetti ne sia la causa:

1. L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece assente negli individui sani;
2. L’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea, ovvero di una sola specie;
3. L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene responsabile;
4. L’agente causale deve essere re-isolato dall’individuo infettato sperimentalmente.

Caratteristiche di un sistema biologico

• Capacità riproduttiva, unica funzione biologica che hanno i virus;
• Assorbimento delle sostanze nutritive e metabolizzazione per ricavare energia;
• Espellere prodotti di rifiuto;
• Reagire a cambiamenti dell'ambiente, irritabilità o eccitabilità, allontanarsi o avvicinarsi ad una situazione favorevole o no;
• Subire mutazioni, variazione del patrimonio genetico che si ripercuotono sul fenotipo.

Animali: sistema nervoso, aerobi.

Monere: procarioti, DNA non associato a proteine quindi non ci sono cromosomi, parete cellulare, unicellulari, microrganismi spesso unicellulari.

Funghi: parete cellulare di solito chitinosa, aerobi o no.

Protisti.

Piante: aerobi, sempre doppia membrana cellulare.

Eubatteri: parete cellulare.

Archibatteri.

Batteriologia

Batteri = schizomiceti perché prima li consideravano organismi vegetali per la loro parete.

La loro classificazione si basa essenzialmente sull'identificazione dei generi e delle specie, le principali tecniche per la classificazione sono:

• Tassonomia numerica, analizzati e valutati una serie di caratteri comparandoli tra loro;
• Analisi genetica;
• Analisi delle sequenze, delle proteine e delle molecole di RNA.

Nella tassonomia abbiamo: Phylum → Classe → Ordine → Famiglia → Genere → Specie.

Le unità tassonomiche sono le specie ovvero gli insiemi di ceppi batterici che mostrano molte caratteristiche fenotipiche comuni che ne permettono la distinzione da altre specie. Il ceppo = CLONE = insieme di cellule geneticamente identiche derivate da una subcoltura di una singola colonia isolata in purezza, si può avere:

• Ceppo tipo, coltura da cui è stata descritta originariamente la specie depositata presso collezione di colture batteriche, esempio permanente della specie;
• Ceppo di referenza, coltura usata per studi di malattie infettive e per diverse applicazioni di laboratorio depositata presso collezioni.

In una stessa specie si hanno:

• Biotipi, ceppi con differenze biochimiche o fisiologiche;
• Sierotipi, ceppi con differenze antigeniche;
• Fagotipi, ceppi con differenze di sensibilità a diversi batteriofagi;
• Resistiotipi, ceppi con differenze nella resistenza agli antibiotici.

Per ogni genere di batteri vanno prese in considerazioni le seguenti caratteristiche:

• Gram;
• Dimensioni;
• Esigenze di ossigeno;
• Morfologia;
• Mobilità;
• Habitat.

Sono misurabili in micron, si riproducono per scissione binaria, possono trovarsi in singole cellule o aggregati, dipende dalle modalità di divisione.

Forme batteriche

Le cellule batteriche possono avere una forma rotondeggiante = Cocchi.

Inoltre se nella scissione diretta alcuni batteri restano:

• Attaccati a due = Diplococchi;

Se sono aggregati:

• Attaccati a catenelle = Streptococchi;
• Attaccati a gruppi = Stafilococchi;
• Attaccati a quattro = Tetradi;
• Attaccati a multipli di quattro = Sarcina.

Le cellule batteriche possono avere una forma a bastoncello = Bacilli.

Se hanno una forma più arrotondata = Coccobacilli.

Se sono aggregati:

• Attaccati a catenelle = Streptobacilli.

Le cellule batteriche possono avere una forma a virgola = Vibrione.

Le cellule batteriche possono avere una forma filamentosa e rigida = Spirilli.

Le cellule batteriche possono avere una forma filamentosa e più flessuosa e sottile = Spirochete.

Capsula

Delimita il batterio dall'ambiente, non è sempre presente, in alcune situazioni ambientali possono averla e in altre no, altri non ce l'hanno proprio.

Strato mucoso spesso variabile non colorabile da coloranti ma con colorazione negativa = si colora solo lo sfondo con l'inchiostro di china, la capsula risulta un alone trasparente attorno alla cellula. Si può inoltre vedere con reazioni immunologiche o con il rigonfiamento della cellula.

Può essere di origine polipeptidica o polisaccaridica, la sintesi è regolata da fattori:

• Genetici, ci devono essere certi geni nel genoma, può essere persa con mutazioni di tipo S-R nelle colonie (aggregati dove le singole cellule non sono distinguibili) con batteri capsulati, lisci o Smooth, possono poi assumere l'aspetto rugoso o Rath senza capsula.
• Fenotipici, fattori ambientali (O₂ e umidità), composizione del terreno, fase di crescita (attiva nella fase riproduttiva).
• Risultato di prodotti sintetizzati dal batterio e secreti, può essere usata come riserva e per questo il batterio in difficoltà o morente non la esprime.

Funzioni:

• Protezione dalla disidratazione perché ricca di acqua;
• Importante fattore di virulenza perché aumenta il potenziale patogeno perché li rende più resistenti e aiuta ad aderire.

Struttura simile, più semplice e più fragile perché le maglie sono più lasse = glicocalice.

Parete

Esclusiva di queste cellule. Presente in quasi tutti i batteri tranne nei MICOPLASMI, agenti di malattie animali, fatto importante perché esistono alcuni farmaci antibatterici (antibiotici) che interferiscono con la sintesi della parete uccidendo così i batteri che ce l'hanno.

Spessa e rigida, protegge, mantiene la forma, protegge da danni osmotici e non la fa scoppiare, inoltre dà immunità perché è in grado di stimolare la sintesi di alcuni anticorpi.

Gram positivi, strato spesso di peptidoglicano, anche 40 foglietti, 40-80% del peso, all'interno da 2 a 3 foglietti. È composta per lo più da PEPTIDOGLICANO = MUREINA, questo polimero è responsabile della rigidità, è formato da lunghe catene lineari disaccaridiche di N-acetilglusammina, NAG, e N-acetilmuramico, NAM, legati a formare foglietti concentrici legati tra loro con due corte catene tetrapeptidiche legate tra loro, composte principalmente da alanina, legate sempre al NAM.

Le maglie, la matrice contiene acidi teicoici, polimeri di alcoli polivalenti uniti da legami fosfodiesterici + glicolipidi = acidi lipoteicoici responsabili della carica negativa della superficie cellulare e possono contribuire al passaggio di ioni, contribuiscono alla forza e all'elasticità, e acidi teiluronici oltre a carboidrati e proteine, tipico è il legame indiretto = legame delle due catene a 5 residui di glicina, si forma quindi un ponte più forte e dà più robustezza allo scheletro, quasi tutti i NAM sono legati alle proteine.

Gram negativi, strato sottile di peptidoglicano, 5% del peso, pochi legami tra i foglietti, hanno una membrana esterna = pseudocapsula = doppio strato lipidico separata dalla membrana = spazio periplasmatico dove ci sono diverse proteine, lipopolisaccaridi danno il carattere negativo e possono agire come endotossina e causare le tipiche infezioni (salmonella), la lipoproteina di Brown connette il peptidoglicano alla membrana esterna, il lipide A è saldamente ancorato alla membrana esterna, tipico è il legame diretto tra le due catene tetrapeptidiche, proteine meno frequenti.

Il peptidoglicano è una molecola grossa con legami forti con amminoacidi alternati D e L, sono numerosi i legami H tra i peptidi, gli ACIDI TEICOIDI e LIPOTEICOICI facilitano l'assorbimento di ioni positivi, favorisce la virulenza. I batteri sono fortemente immunogenici perché danno forte risposta immunitaria.

La membrana esterna dei Gram negativi è fatta da liposaccaridi, per lo più, e fosfolipidi, la componente lipidica è data dal lipide A che rappresenta un fattore tossico, LEVITOSSINA, è la porzione effettivamente responsabile del potere patogeno.

Membrana citoplasmatica

Può presentare invaginazioni = MESOSOMI.

Simile alla membrana degli eucarioti perché è un doppio strato fosfolipoproteico, sono assenti gli steroli ma ci sono molecole pentacicliche simili = OPANOIDI, probabilmente hanno la funzione di stabilizzare la membrana, e ci sono più proteine non glicosilate.

Interagisci con l'esterno con l'assunzione di sostanze nutritive e l'eliminazione dei metaboliti di rifiuto, individua i segnali ambientali per la chemiotassi, è il centro di attività metaboliche come respirazione, perché sono presenti sistemi per il trasporto di elettroni, fotosintesi, sintesi dei lipidi, sintesi dei costituenti parietali, è una barriera di permeabilità, facilita il trasporto dei tessuti.

È stabilizzata dalle interazioni idrofobiche e legami idrogeno tra lipidi vicini. Alcune proteine si muovono nel piano della membrana, il risultato è una membrana fluida con la consistenza di un olio.

Citoplasma

• Nucleo nel nucleoide.
• Granulociti, materiale di riserva ma poco perché queste cellule hanno un turnover elevato, si approvvigionano e si riproducono velocemente.
• Molecole di DNA circolare piccole distanziate dal nucleoide chiamati plasmidi.
• Appendici, possono esserci o no e sono di due tipi:

• Flagelli, più filamentosi e più grandi, servono a muoversi, di natura proteica, il numero e la zona di inserzione sono variabili e usati come criteri di classificazione, i batteri infatti sono divisibili in:
  • Monotrichi, 1 flagello, estremità;
  • Anfitrichi, 2 flagelli, estremità;
  • Lofotrichi, più flagelli, estremità = ciuffo;
  • Peritrichi, più flagelli sparsi.

I flagelli non sono visibili al microscopio a meno che non si incrementi il loro diametro con speciali coloranti, acido tannico, si possono visualizzare indirettamente tramite la loro mobilità, terreni semisolidi o vetrino a fresco, si compongono di tre parti:

• Filamento, subunità uguali di flagellina;
• Uncino;
• Corpo basale.

Sono inoltre importanti gli antigeni H alla base della classificazione sierologica di molti microrganismi. Il movimento rotatorio si origina dal corpo basale che funzionerebbe come motore grazie alle proteine Mot, altre proteine, Fli, fungono da invertitori ribaltando la rotazione del flagello in risposta a segnali intracellulari, il risultato è un avanzamento in linea retta con capovolgimento. L'energia richiesta per la rotazione proviene dalla forza proton-motrice, la velocità di rotazione varia a seconda della specie e dell'energia, il movimento dei microrganismi con flagelli polari o lofotrichi è diverso da quello con flagelli peritrichi. Più di 40 geni sono coinvolti nella crescita e sintesi dei flagelli, la sintesi inizia con l'assemblaggio dell'anello MS nella membrana, seguita dalla formazione di altri anelli, dell'uncino e del cappuccio, le molecole di flagellina scivolano all'interno dell'uncino per formare il filamento sono guidate nella corretta posizione dalle proteine del cappuccio che assicurano al filamento crescente uno sviluppo ordinato, queste molecole sono sintetizzate nel citoplasma e passano all'interno del canale all'interno del filamento e vengono assemblate all'estremità terminale.

Infine permettono la chemiotassi = capacità dei batteri di avvicinarsi o di allontanarsi da particolari sostanze chimiche, questa può essere:

• Positiva, avvicinamento;
• Negativa, allontanamento.

Il fenomeno può essere messo in evidenza mediante il metodo dei capillari.

• Fimbrie, più corte dei flagelli e più numerose, non sono coinvolte nel movimento ma probabilmente nell'adesione ai tessuti;
• Pili, simili alle fimbrie ma più lunghi e meno numerosi, anche questi servono ad aderire ai tessuti, sono costituiti da subunità di pilina, la cui espressione è regolata da un complesso genico Pil, è formata da un'estremità NH3 che si conserva nei vari gonococchi e da una COOH che è invece estremamente variabile e per questo è difficile fare un vaccino. I pili si dividono in:
  • Comuni, più numerosi, strutture adesive, sono fattori di colonizzazione, a volte hanno proprietà antifagocitarie;
  • Sessuali, massimo 10 a cellula, sono più lunghi dei comuni, intervengono nella coniugazione e rappresentano spesso dei recettori per i batteriofagi.

Sono i principali fattori di virulenza di Nisseria gonorroea perché mediano l'attacco alle cellule epiteliali non cigliate dell'epitelio uro-genitale e conferiscono resistenza all'aggressione da parte dei neutrofili.

Spore

Alcuni microrganismi appartenenti ai generi Bacillus o Clostridium possono, in condizioni ambientali sfavorevoli, andare incontro ad un particolare processo di differenziazione = SPORIFICAZIONE reversibile e porta alla produzione di una spora batterica che rappresenta una forma di vita quiescente e particolarmente resistente al calore e agli agenti chimici e fisici con caratteristiche strutturali e fisiologiche molto diverse da quelle della cellula vegetativa che l'ha prodotta. La sporificazione si evolve in stadi morfologici correlati a profonde modificazioni biochimiche:

1. Formazione del filamento assiale;
2. Formazione del setto asimmetrico;
3. Formazione della pre-spora;
4. Formazione della corteccia, secondo le stesse vie biosintetiche che portano alla formazione del peptidoglicano della cellula vegetativa, responsabili delle modificazioni strutturali sono gli enzimi spora-specifici, è probabile l'esistenza di due apparati biosintetici distinti associati con la membrana esterna e interna;
5. Formazione delle tuniche o coats, vengono sintetizzate le proteine spora-specifiche ricche di zolfo;
6. Completamento dei rivestimenti della spora;
7. Liberazione dell'endospora per lisi dello sporangio, si ha l'accumulo di numerose autolisine che si accumulano nello sporangio subito prima della lisi.

L'intero processo è dato da:

1. Attivazione, reversibile, spore pronte a germinare se esposte alle condizioni di induzione;
2. Germinazione propriamente detta, irreversibile, richiede la presenza di un induttore, nucleosidi purinici, e taluni amminoacidi, L-Ala, possono potenziare l'effetto degli induttori:
   1. Fase rapida, pochi minuti;
   2. Perdita della termoresistenza e rifrangenza;
   3. Metabolismo di tipo degradativo;
   4. Sintesi di ATP da 3PG;

Si ha poi la regolazione genica, geni ger organizzati in almeno 3 operoni;

3. Esocrescita, intensa sintesi proteica, della parete e del DNA, poi divisione cellulare.

La regolazione della sporificazione coinvolge più di 100 geni nel Bacillus subtillis, si ha l'espressione di geni spora-specifici in sequenze temporali definite identificate con l'impiego di mutanti bloccati a stadi morfologici specifici.

Le spore sono circa 10 volte più resistenti all'azione di disinfettanti o radiazione e sono circa 100 mila volte più resistenti all'inattivazione termica dovuta al grado elevato di disidratazione.

Protoplasto

La spora è formata da: Protoplasto.

Rappresenta il citoplasma, contiene perciò tutto il necessario per produrre una cellula completa:

• Un cromosoma;
• Componenti stabili del sistema proteosintetico;
• NO RNA;
• Proteine enzi