Metodologie genomiche e molecolari

Metodologie genomiche Zappavigna 2018/2019

3 ottobre - Estrazione DNA da batteri

Strategia generale

• Una coltura di batteri viene fatta crescere e viene raccolta: in una beuta viene fatto un terreno di coltura.
• In seguito, la beuta viene messa all'interno di uno shaker termostatato a 37 gradi (la temperatura è relativa al ceppo più utilizzato Escherichia coli).

Il mezzo di coltura può essere diviso in due grandi categorie:

• M9: contiene sali e solo elementi essenziali. Viene anche chiamato terreno minimo definito.
• LB (Luria-Bertani): terreno con triptone, ottenuto da una proteolisi della caseina attraverso tripsina e altri aminoacidi, estratto di lievito con vitamine, coenzimi ecc. Di questi componenti però non sappiamo la concentrazione di ogni elemento. È un terreno massimo, cioè ricco. Il secondo terreno viene utilizzato maggiormente.

La coltura viene fatta passare all'interno di uno shaker per farla crescere in condizioni aerobiche. I batteri vengono fatti crescere fino a una certa densità. Essi proliferano in maniera esponenziale fino a quando non si raggiunge un plateau nella curva di crescita. Per determinare il numero di batteri in una coltura liquida si utilizza la spettrofotometria, che valuta la densità. Lo spettrofotometro calcola l'assorbanza, ovvero quanta luce oltrepassa il campione avente una certa densità batterica.

Nel spettrofotometro abbiamo una sorgente di luce, uno spazio per il campione e un misuratore di luce. Le provette rettangolari, in cui viene posto il campione, vengono chiamate cuvette e possiedono uno spessore di 1 cm. La luce di 600 nm, quindi, attraversa questo spessore. Sono state costruite delle curve standard e si sa che a ogni densità ottica equivale una certa densità batterica.

Estrazione e purificazione del DNA plasmidico

Per estrarre il DNA plasmidico si deve eliminare la parete, con l'utilizzo del lisoenzima, il quale scinde i polisaccaridi della parete. Il tutto viene fatto in una soluzione di saccarosio, per mantenere una certa isotonicità della soluzione (la cellula in questo caso potrebbe esplodere). Si ottengono così degli sferoplasti, cellule che perdendo la parete, sono divenute sferiche.

La lisi viene effettuata attraverso un detergente come il triton X-100 (detergente non ionico, che non denatura la proteina), in cui si ha la rottura della membrana plasmatica. A questo punto le componenti si separano attraverso il peso molecolare, tramite centrifugazione. Si ha così una sedimentazione delle molecole più pesanti a formare il pellet e nel sovranatante si troveranno le molecole più piccole.

Le cellule sono rimosse e rotte per ottenere un estratto cellulare. Il sovranatante conterrà non il plasmide intero, ma DNA plasmidico, RNA e proteine. Nel pellet vi sarà invece il cromosoma batterico.

Purificazione del DNA dall'estratto cellulare

• Si eliminano i contaminanti che non ci interessano, oppure si separa ulteriormente il DNA dai contaminanti.
• Un modo per eliminare proteine nel sovranatante è l'estrazione con solventi organici. Questa tecnica viene attuata con una miscela 1:1 di fenolo e cloroformio. Questi non si mescolano con le soluzioni acquose, ma se messi a contatto ed emulsionati con queste, sono in grado di creare un'emulsione composta da una fase acquosa e una organica. Le proteine tenderanno a precipitare dopo centrifugazione.

Alla fine, si otterrà una fase acquosa, un'interfaccia tra la fase acquosa e organica e si avrà un precipitato bianco, dato dall'RNA e DNA plasmidico. Si recupera quindi la fase acquosa.

Un'altra strategia di separazione è data dalla centrifugazione in gradiente di densità. Per attuare questa separazione con elevato grado di purificazione, si utilizza un'ultracentrifuga. Il DNA e le altre componenti in questa tecnica presentano diversa densità. Il bromuro di etidio viene utilizzato per alterare la densità del DNA.

Se si prende un DNA batterico cromosomico e il plasmide e li si pongono a contatto con una soluzione di bromuro di etidio, si notano delle differenze di densità. Il DNA batterico viene denaturato abbassandone la densità. Il DNA plasmidico, invece, è in grado di catturare meno etidio bromuro e la sua densità sarà maggiore rispetto a quello cromosomico. Per creare un gradiente di densità nella provetta si utilizza cloruro di cesio, che viene centrifugato.

La densità sarà maggiore nel fondo della provetta e via via sempre minore fino a raggiungere il tappo. Mescolando gli estratti di DNA, si noteranno delle bande: una più bassa corrispondente al DNA plasmidico e una più leggera corrispondente al cromosomico. Le proteine risulteranno essere in alto. Si recupera poi, attraverso una siringa per mezzo di un buco sulla provetta, la banda più pesante.

Eliminazione di contaminanti

• All'interno della banda pesante, non vi è solo il plasmide, ma anche il bromuro di etidio e il cloruro di cesio, che dovranno essere eliminati. Il bromuro di etidio si estrae con un solvente organico (il bromuro di etidio in un solvente organico, passa dalla fase acquosa a quella organica) e il cloruro di cesio invece attraverso la dialisi.
• In quest'ultima è presente una membrana di dialisi in cui viene messa la soluzione di cloruro di cesio e DNA plasmidico. Il sacchettino da dialisi (membrana di dialisi) funge da setaccio e viene posto in un litro di tampone, facendo passare solo il cloruro di cesio. Nel sacchettino, perciò, rimarrà solo DNA plasmidico.

Pulizia finale del DNA

Vi è anche un'altra strategia: quella della lisi alcalina. Questa tecnica prevede una rottura dei batteri in un tampone, che grazie alla presenza di NaOH, rende basica la soluzione. Si separano perciò facilmente le due eliche. Il DNA plasmidico ha più facilità, successivamente, a rinaturarsi. Si riporta infatti il pH alla neutralità. Il DNA cromosomico non riesce a rinaturarsi, formando un grosso aggregato a seguito di centrifugazione. Il DNA plasmidico si rinatura invece, rimanendo in soluzione. Esso infatti, a seguito di centrifugazione, rimane sul surnatante.

• Concentrazione del DNA: viene effettuata attraverso disidratazione delle molecole di DNA e permettere la loro precipitazione. Questa tecnica utilizza anche sali, per neutralizzare le cariche negative del DNA in modo da facilitarne l'aggregazione. Si aggiungono poi almeno 3 volumi di alcool. Le molecole di DNA si disidrateranno e andranno a costituire il pellet. L'etanolo, invece, sarà presente nel sovranatante.
• Il plasmide viene risospeso in soluzione di 10 mM tris Hcl e 1 mM EDTA (elimina ioni magnesio per proteggere il DNA dall'attacco di enzimi) e trattato con RNAsi per eliminare le molecole di RNA.

Purificazione del plasmide mediante cromatografia a scambio ionico

Si utilizza una resina carica positivamente, chiamata DEAE, per catturare DNA carico negativamente. La resina appare come delle sferette, che vengono aggiunte all'estratto. La resina tratterrà il DNA plasmidico e dopo un lavaggio si elimineranno i contaminanti. Si avrà poi un'eluizione per recuperare il DNA plasmidico, staccandolo dalla resina.

Altro trucco basato sulla cromatografia è la guanidina-tiocianato. Questa sostanza è denaturante per le proteine. Il DNA rimane intatto a contatto con questa sostanza e possiede un'affinità particolare per sferette di silicio (vetro). Il DNA, perciò, rimane attaccato alle sferette e i contaminanti vengono lavati via. Successivamente si effettua un'eluizione del DNA recuperato, staccandolo dalle sferette. Il DNA risulterà essere sul fondo della provetta.

Clonaggio

Tra i vettori di clonaggio non troviamo solo plasmidi, che non riescono ad ospitare molecole troppo grandi in quanto diverrebbero instabili, ma anche PAC, COSMIDI e BAC. Lo sviluppo di questi vettori ad alta capacità di ospitare molecole così grandi, è stata necessaria per costruire librerie genomiche. L'estrazione di frammenti di DNA dal gel dopo averlo digerito con enzimi di restrizione e separato con elettroforesi può avvenire brutalmente tagliando direttamente il gel. Per separare il DNA dall'agarosio si può fare:

• Elettroeluizione
• Colonne a scambio ionico
• Agarosio a basso punto di fusione low melting: temperatura che scioglie agarosio in modo da non denaturare il DNA.

Ligazione

Per effettuare la ligazione, viene utilizzata una ligasi (non fa riparazione del DNA) che lega filamenti anche non coesivi, quella del fago T4. La T4 DNA ligasi utilizza ATP per creare il legame fosfodiesterico. Il vettore però, può anche richiudersi su se stesso, perciò bisogna favorire la reazione di ligazione. Si può attuare ligazione con un rapporto molare tra vettore e inserto a favore di quest'ultimo (più inserto rispetto al vettore). In questo modo si aumenta la probabilità che esso non si chiuda su se stesso. Per far questo si tiene conto del peso molecolare del plasmide e dell'inserto.

Es: rapporto 1:6

Plasmide PM=990.000

Inserto PM= 495.000

Moli plasmide in 10 ng: 10/990.000= 0,01 pmol

Per avere un rapporto 1:6 mi servono 0,06 pmoli di frammento quanti ng di frammento userò per la ligazione?

0,06x495.000=30 ng

Dimensione inserto/dimensione vettore x molecole inserto/molecole vettore x quantità vettore (ng) = quanto inserto (ng)

Per favorire la ligazione esiste un altro trucco, dato dalla fosfatasi alcalina. Se si prende un vettore, tagliato con Ban, esso presenterà dei gruppi fosfati in 5’. Eliminando quest’ultimi, il vettore non potrà richiudersi in assenza dell’inserto.

10 ottobre

La ligazione può avvenire tra estremità piatte, anche se non è favorita. Questo è possibile grazie alla T4 DNA ligasi. Si possono rendere anche blunt delle estremità non coesive, attraverso una DNA polimerasi. Essa però, è modificata, è il frammento Klenow in grado di sintetizzare in direzione 5’-3’ senza però avere attività esonucleasica. Mentre nelle 5’ protrundenti la sintesi è facile aggiungendo solo l’enzima e la polimerasi, quelli in 3’ necessitano della rimozione dei nucleotidi, utilizzando una polimerasi di origine fagica, ovvero la T4 DNA pol (con attività 3’-5’ esonucleasica). Essa in assenza dei nucleotidi degraderà i nucleotidi presenti nel filamento, rendendo l’estremità blunt. Ai siti di restrizione, facendo queste manipolazioni, succede che non si ricostituiranno (non è possibile separare il vettore dall’inserto). Altro modo per adattare inserti con un certo enzima di restrizione ad vettori tagliati con altri enzimi, è l’utilizzo di linker. Solitamente sono oligonucleotidi vendibili da ditte. Saranno perciò oligonucleotidi blunt non fosforilati. La prima cosa da fare quindi è fosforilare in 5’ utilizzando una nucleotide chinasi. Si può quindi legare questi linker, aventi siti di restrizione, alla molecola.

Essendo questi linker piccoli, è molto probabile che non si attacchino solo 2 molecole di linker una a valle e una a monte dell’inserto, ma si originano concatameri. Queste unità concatenate vengono tagliate attraverso gli enzimi di restrizione. Perciò, si otterrà un inserto con ai lati i linker. Questa tecnica può essere utilizzata per il sequenziamento di geni sconosciuti. In una tipica ligazione perciò, abbiamo mescolato un DNA con enzima di restrizione e un inserto. Abbiamo 3 situazioni:

• Richiusura del vettore su se stesso.
• Ligazione dell’inserto può legarsi tra se stesso e formare un concatamero. Il batterio in questo caso non trasformerà questo inserto.

Trasformazione

Alcuni ceppi batterici possiedono la capacità di internalizzare il DNA dall’ambiente. Questa capacità non è normale, perché i batteri in natura solitamente si scambiano DNA attraverso coniugazione. Se in natura avviene trasformazione, questa si verifica verso la fine della fase di crescita esponenziale. Divengono perciò, questi batteri competenti. La competenza naturale è però statisticamente molto bassa e rara. Per far fronte a questo si è pensato di lavorare sulla competenza, aumentandola attraverso il trattamento di calcio cloruro verso la fine della fase esponenziale. Ancora però, non si sa il meccanismo con esattezza. L’unica cosa di cui si hanno certezze è che il calcio cloruro aumenti l’adesività del DNA alla superficie del batterio e che probabilmente faccia aprire dei pori nella parete per aumentare l’entrata.

Successivamente è stato scoperto che se si fa un’incubazione molto breve (1 min e mezzo) a 42 gradi (temperatura heat-shock) dopo il trattamento con calcio cloruro, si favorisce l’internalizzazione. Questo risulta essere un metodo chimico, ma ne esistono altri. Il metodo però del calcio cloruro non possiede un’efficienza di trasformazione molto alta. Oltre a E. coli esistono altri ceppi, che sono stati modificati in laboratorio per effettuare queste manipolazioni.

Ceppi comuni di E. coli di laboratorio

• DH5alfa: permette alfa complementarizzazione. Infatti produce una betagalattosidasi non intera. Possiede un’altra mutazione nel gene recA, sono perciò ricombinazione difettivi (non attuano ricombinazione). Questo permette stabilità nel plasmide. DH5alfa viene utilizzato perché riesce ad ottenere delle efficienze di trasformazioni da 10⁶ a 10⁹ cfu\microgrammo.
• XL1Blue: mutazione in galattosidasi e recA.
• INV110: possiede sistemi di metilazione (codificate dal genoma batterico), in grado di aggiungere CH₃ in corrispondenza di alcune zone del DNA. Alcuni enzimi di restrizione non riescono ad agire se sono presenti dei dam. Questi ceppi sono difettivi di tali sistemi.

Finito lo shock termico, il gene portato dal plasmide deve esprimersi. Per far fronte a questo deve essere aggiunto del nuovo terreno massimo e in seguito si fa un’incubazione. Si da al batterio tempo per produrre tale enzima. Poi si attua una piastrazione in un terreno solido. Esso è un BL a cui viene aggiunta l’agar per renderlo semi-solido. Altra tecnica per rendere i batteri più competenti è l’elettroporazione. Questa permette di fare pori nella parete batterica, attraverso una scossa elettrica. Quindi possiamo dire che questo metodo risulta essere fisico. Questo trattamento però, uccide la maggior parte dei batteri, ma i sopravvissuti possederanno il vettore.

Nei metodi chimici più le molecole da internalizzare erano grandi, minore era l’efficienza. Con questa tecnica però, la dimensione non influenza l’efficienza. Infatti nel tempo, si è sempre più avuta la propensione ad aumentare la dimensione degli inserti. Il macchinario utilizzato è un elettroporatore, con una specie di trappolina in cui verrà posto il DNA. Inoltre, sono presenti degli elettrodi. Per far questo si utilizzano cuvette con all’interno elettrodi di metallo.

Clonaggio

A questo punto abbiamo ottenuto delle colonie su una piastra. Se abbiamo utilizzato colonie bianche e blu, la visione del clonaggio è più facile e bisogna solo capire se non siano presenti falsi positivi. Per far questo si utilizzano le miniprep (preparazione su piccola scala). Ogni colonia viene trasferita in una provetta con 3 ml di terreno con all’interno antibiotico. In queste si fanno crescere i batteri per una notte. Queste mini colture risulteranno essere torbide. La restante parte di coltura viene riutilizzata, perché una volta estratto il DNA e si è verificato che esso derivi da batterio ricombinante, si può riutilizzare. Dalle provette attraverso lisi alcalina si recupera il DNA. In una seconda provetta otterremmo 2 microgrammi di DNA plasmidico. Si utilizzeranno gli enzimi di restrizione e si fa una corsa elettroforetica. Nella corsia 1 abbiamo uno standard molecolare e nelle altre corsie vari DNA. Nel caso in esame nella corsia 2 abbiamo solo la banda del vettore, sarà perciò una colonia non ricombinante. Nella corsia 3 abbiamo un plasmide non digerito dall’enzima di restrizione. In questa si avranno 2 bande, essendo sia lineare che superavvolto. Nelle corsie 4-5-6 abbiamo solo l’inserto e il vettore vuoto. Solo quest’ultime corsie avranno il plasmide ricombinato.

È desiderabile, in alcuni casi, fare un clonaggio orientato dell’inserto. Il pcDNA3.1 possiede un pCMV (promotore virale) e siti di restrizione. Noi dobbiamo inserire un cDNA, quindi si deve orientare l’inserto rispetto al vettore. Per far questo si utilizzano 2 enzimi diversi di restrizione per clonare un cDNA, possedente una direzione di trascrizione. Questi enzimi sono HindIII e EcoRI, che fanno sì che il vettore non possa mai richiudersi su se stesso. Le estremità risultano essere incompatibili. Si aggiunge poi, l’inserto, che non può inserirsi se non nell’orientamento giusto. Si ha perciò, un clonaggio forzato, in cui si forza l’inserto a inserirsi in una determinata posizione. Si effettua poi una miniprep con digestione doppia e si fa un’elettroforesi per verificare che le colonie siano ricombinanti. Le colonie ricombinanti possono venire fuori se il vettore risulta essere digerito solo da uno dei due enzimi di restrizione.

È possibile anche identificare dei trasformanti anche se il clonaggio non è forzato. Se noi abbiamo un frammento tagliato con bgM, l’inserto può orientarsi in due modi. Per verificare quale sia l’orientamento giusto e che quindi siano ricombinanti, si ricorre ad un altro enzima di restrizione sapendo la mappa del nostro inserto. Questo ci permette di capire l'orientamento corretto.