Metodologia della ricerca scientifica

Metodologia della ricerca scientifica

Luconi Michaela

A.A. 2021/2022

La ricerca scientifica nel III millennio: la figura specialistica del biotecnologo – Lez.1, 21.04

Iniziamo col dire che ci sono tante figure che fanno ricerca, ognuno in un proprio ambito, quindi biologo, medico, chimico e quant’altro, e diciamo che la figura del biotecnologo e il biologo sono simili, ma il biotecnologo ha un aspetto pratico, laddove il biologo è più un teorico, quindi il biotecnologo traduce in pratica le competenze che ha sviluppato.

Fondamentalmente siamo un “tramite” tra la conoscenza di base e quelle che sono le applicazioni tecnologiche e tecniche. E tra l’altro quello che abbiamo come conoscenza ci permette di fare ricerca non solo nell’ottica di sviluppare nuove conoscenze, ma sviluppare nuovi tool tecnologici e strumenti applicativi.

E se vediamo su PubMed gli articoli biotecnologici, escono circa 500.000 risultati, dove si ha avuto un incremento esponenziale dagli anni ’90 ad oggi. Questo per dire quanto le biotecnologie siano in crescita esponenziale, e se mettiamo per esempio su Google “biotech startup” si ottengono oltre 24mln di risultati. Quindi diciamo che le biotecnologie sono in continua evoluzione.

E tenendo conto degli aspetti in cui si classifica la ricerca, possiamo parlare di ricerca di base, clinica, applicata e infine ricerca traslazionale, dove quest’ultima è effettivamente quella in cui il biotecnologo si colloca. Vedendo le differenze:

• Ricerca di base, porta a uno sviluppo di conoscenze in un certo ambito, con lo scopo di ampliare le conoscenze in uno specifico ambito, e il risultato finale non si vede nell’immediato, perché possiamo dire che più che risolvere problemi, tende a crearne di nuovi e spesso si aprono infatti a catena sempre nuovi quesiti, ed è la base su cui si sviluppano ricerche sempre più applicative. La ricerca di base infatti non prevede un’applicabilità nell’immediato.
• Ricerca clinica, ha come oggetto effettivamente il paziente, si muove nell’ambito delle patologie e dobbiamo vederla anche in studi epidemiologici, e nell’ambito della possibilità di ottenere risultati di tipo gestazionale, quindi non sempre si applica solo al paziente, ma possiamo vederla come quella ricerca per ottimizzare le strutture che seguono il paziente, quindi è quella ricerca anche che si usa per gestire al meglio un ospedale e le varie procedure mediche e organizzative. Quindi quella che la distingue dalle altre ricerche è l’oggetto, che è o il paziente nella sua patologia, oppure il sistema che gestisce il paziente.
• Ricerca applicata, spesso è commissionata da compagnie farmaceutica che intende studiare per esempio un farmaco, quindi abbiamo quel fine applicativo che non c’è nella ricerca di base, e si cerca di arrivare a un prodotto finito che arriva nel mercato.
• Ricerca traslazionale, abbiamo un risultato immediato, quindi porta alla creazione di qualche cosa, un tool e all’ottenimento di un risultato concreto che si mette nel mercato, in clinica, ed è un ponte tra conoscenze e applicazione pratica. Una delle caratteristiche di base della ricerca traslazionale è anche quella di usare e sviluppare nuove tecnologie, quindi sfrutta elementi di avanguardia, tecniche molto innovative e porta anche a sviluppare tecnologie innovative stesse. Pensiamo quindi che la ricerca traslazionale non porta solo a sviluppare un farmaco o una strategia terapeutica, ma porta a sviluppare strumenti tecnologici, quindi un saggio che ci fa analizzare una tecnologia per esempio. La medicina traslazionale quindi permette di sviluppare tecnologie avanzate e permette anche di mettere insieme competenze e multidisciplinarietà di molte figure professionali. Ed è molto importante riuscire a mettere insieme competenze diverse, si parla infatti sempre di network, e bisogna mettere insieme tante competenze diverse ed è molto importante perché non esistono più figure la cui elevata competenza abbraccia tanti aspetti della biomedicina insieme. Quindi altra caratteristica di questa ricerca è di mettere insieme tutte queste competenze ed il biotecnologo è il ponte tra queste competenze, tanto che è il soggetto che poi deve tradurre il tutto in un risultato concreto. E nella medicina traslazionale è importante il flusso bidirezionale tra quesito clinico e la parte sperimentale che avviene in laboratorio, quindi c’è continuo scambio tra il clinico, o comunque anche il biologo che è più a contatto con la condizione patologica o da studiare, e la parte laboratoristica, e viceversa. Ancora una volta ecco che emerge la traslazionalità per non far rimanere i risultati fermi e limitati al laboratorio.

Medicina di precisione e approccio personalizzato

Inoltre, mentre negli anni precedenti si è cercato soprattutto di trovare un comune denominatore delle varie patologie permettendo così di trattare spesso pazienti allo stesso modo, ad oggi invece si è visto che non basta, infatti la presenza di tanti soggetti non risponder a un trattamento, raggruppati per patologia, ha portato a pensare che ogni soggetto possa avere delle caratteristiche individuali che permettono di far rispondere in modo unico verso quel tipo di trattamento e patologia, e da qua nasce la medicina di precisione con un approccio così detto personalizzato.

Sicuramente dal punto di vista dello sviluppo di un farmaco è molto costoso, infatti fare un farmaco diretto a una piccola parte della popolazione, per una industria è meno remunerativo. Quindi oggi si va cercando, dentro ogni patologia, di trovare quei tratti specifici di ogni paziente per fare una terapia mirata, cercando quindi di capire la singolarità di ogni paziente.

Vediamo quindi le tecnologie che abbiamo a disposizione nel mirare alla singolarità del paziente, quindi come dicevamo l’idea è di passare da un trattamento generale per pazienti raggruppati per patologia, ad una medicina personalizzata futura che da una parte tiene sempre conto del comune denominatore della malattia, ma poi tiene anche conto delle caratteristiche individuali di ogni soggetto.

Quindi si cerca di sviluppare modelli in vivo in cui si sviluppa la malattia usando materiale proveniente dal paziente, in primis lo xenotrapianto per tumore in cui si recupera materiale tumorale dal paziente e poi viene impiantato nell’animale per far sopravvivere quel frammento tessutale e su quel micro-tumore relativo al paziente, si va a testare la medicina personalizzata vedendo gli effetti ex-vivo, ma in vivo nel modello animale, e prevedere quello che sarà l’effetto nel paziente stesso.

Poi si ha anche lo sviluppo delle IPSC, ovvero usando cellule dell’organismo

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che sono facilmente aggredibili e sono cellule dell’epidermide e derma, e sono riprogrammate verso una condizione specifica della cellula che vogliamo studiare nell’alterazione del paziente e queste cellule contengono l’informazione genetica del paziente.

Infine abbiamo il sistema degli organoidi che sono strutture ottenute a partire da singole cellule ma che non si mettono su piastra, quindi con conformazione mono-layer che altera la risposta a certi farmaci, ma mantengono la strutture tridimensionale e l’interazione intra-cellulare replicando così al massimo la condizione patologica in vivo nel paziente. Vedendoli uno a uno:

• Xenotrapianti personalizzati, sono fatti prendendo una parte di una biopsia tumorale del paziente, impiantandola in un topo, ovviamente c’è una fase di espansione in cui cerchiamo di avere tanti frammenti impiantati in diversi topi, in modo da testare su questo materiale in vivo, i vari farmaci. Lo xenotrapianto si fa o iniettando cellule disgregate del tumore, per esempio sottocute, oppure si fa in modo ortotopico, ovvero se studio un tumore epatico, invece che metterlo sottocute, cosa che potrebbe alterare lo sviluppo di quel tumore a causa di tanti fattori diversi, come vascolarizzazione diversa, interazioni cellulari e microambienti diversi, lo metto direttamente nella sede corrispondente a quella da cui deriva il tumore nel paziente, rispettando così la varietà delle cellule e la nicchia tumorale.
• Xenotrapianto con modifiche al SI, ovvero in ogni caso nel modello precedente il topo accettore deve esser immuno-depresso per non dare risposta immunitaria inter-specie, quindi lo xenotrapianto si fa in animali o parzialmente immunodepressi rimuovendo la risposta T, quindi sono bloccati a livello del timo, bloccando i linfociti T che sono quei principali attori del rigetto, oppure totalmente immuno-compromessi e non presentano nemmeno la parte B. In queste strategie, quando mettiamo il pezzo del tumore del paziente, perdiamo quella risposta immunitaria che può essere stimolata dal trattamento farmacologico che testiamo, perché spesso oggi sono farmaci mirati nello stimolare il SI del soggetto verso le cellule tumorali, eliminando così con le sue forze il tumore stesso. Quindi in questi modelli di xenotrapianto con animali immunodepressi o depleti, si perde del tutto questa componente. Allora è stato ideato questa evoluzione dello xenotrapianto in cui l’animale è comunque immunodepresso, ma il suo SI è sostituito da cellule del SI purificate dal paziente. Quindi l’animale subisce 2 trapianti, sia lo xenotrapianto tumorale, sia il trapianto con le cellule immunitarie del paziente, ricreando il sistema immunitario al topo immunodepresso, ma con le caratteristiche del topo. Quindi, sicuramente questo tipo di modello ha permesso un avanzamento importante per testare in modo personalizzato anche questo tipo di terapie farmacologiche che si basano proprio sull’agire sul SI.
• IPSC, questo sistema si basa su una tecnologia sviluppata da Thomson e Yamanaka che hanno isolato cellule pluripotenti, appunto la cellula staminale embrionale dalla blastocisti ed è stato sviluppato un sistema di differenziamento specifico di questa cellula, coinvolgiate verso una linea specifica cellulare. Quindi queste cellule sono usate e differenziate in modo specifico in vitro verso una linea particolare. E l’evoluzione è quella di usare una cellula pluripotente, ma derivante dal fatto che si recupera una cellula differenziata, come una cellula dell’epidermide, de-differenziandola, creando una cellula che si avvicina alle potenzialità di una staminale embrionale, ottenendo quindi una cellula pluripotente. Da qui si sviluppa poi un protocollo per differenziare in modo specifico sulla linea che ci interessa riprogrammando la cellula. È stato quindi possibile de-differenziare una cellula differenziata, ridifferenziarla verso un’altra linea specifica con alterazioni che portano a malattia nel paziente, senza bisogno di dover prendere quella cellula o sistema cellulare dal paziente nella sede della malattia. Quindi questo è utile per tutti quei tessuti che sono per esempio poso accessibili per fare biopsia, quindi si prende una cellula più accessibile e permette, da una parte di studiare la mutazione del paziente, ma permette anche di pensare a applicazioni di terapie cellulari. Per esempio classica è l’idea che nell’infarto al miocardio si prendono cellule non cardiache, si de-differenziano e si fanno differenziare in cellule miocardiche re-immettendole andando a riparare il danno dell’infarto. Quindi in questo modo si prende una cellula da un sistema funzionante più aggredibile e accessibile, andando a differenziarla in modo del tutto diverso re-impiantandola dentro il paziente. E quindi abbiamo questi due scopi, da una parte si possono usare come studio per la medicina personalizzata, ma permettono anche di avere uno scopo terapeutico, ottenendo quindi materiale sostitutivo all’organo

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• Disfunzionante. In ambito però della ricerca, la cosa importante è di capire quei meccanismi di differenziamento alla base di un risultato ottenuto, in modo tale da poter applicare questa metodica con sicurezza e con risultati duraturi, quindi questo, una volta quindi ottenuto un risultato, è importante capire il perché lo abbiamo ottenuto. Quindi lo scopo della ricerca non è solo applicare una tecnologia, ma anche capire il perché questa tecnologia funziona, cosa che poi permette anche di fare nuovi quesiti e eventualmente ci permette di fare anche nuove scoperte scientifiche.
• Organoidi umani, l’organoide è una strutture tridimensionale che otteniamo da singole cellule, che da una parte riproduce una struttura spaziale, ovvero l’informazione dell’organo che vogliamo studiare, cosa che non avviene se lavoriamo in piastra in cellule adese alla plastica che fanno un mono-layer, e la struttura tridimensionale è importantissimo per regolare la struttura, forma e funzione della cellula. Per esempio, e proteine hanno tutte una sequenza primaria, che però non è sufficiente per attivare le funzioni delle proteine, che devono quindi avere un folding e quella proteina che non assume questa tridimensionalità è disfunzionante. L’informazione legata alla tridimensionalità dell’organo è altrettanto importantissima per regolare le singole cellule che formano l’organo. L’altro aspetto che si ottiene nell’organoide è la varietà cellulare, infatti l’organo spesso non è fatto da un solo tipo di cellule, per esempio nel pancreas abbiamo tutte una serie di cellule a diversa secrezione, poi c’è vascolarizzazione, poi la strutture stromale dei fibroblasti, poi la parte immunitaria ecc… Quindi nello studiare l’effetto di un farmaco in un mono-layer ci perdiamo tutta la tridimensionalità e eterogeneità cellulare alla base della funzione d’organo. Nell’organoide quindi è possibile ricreare una struttura tridimensionale potendo inserire cellule che contribuiscono alla funzione d’organo, rispettando molto di più la funzionalità. Per esempio vediamo come organizziamo un organoide per rispettare la ghiandola surrenalica. È una ghiandola doppia posta sopra il rene che ha una parte midollare che ha origine embrionale diversa dalla corticale e la midollare fa catecolammine ovvero adrenalina, DOPA e noradrenalina. La corteccia è fatta da cellule con funzioni diverse, strutturata in cellule esterne che secernono ormoni importanti per la regolazione della pressione, come i mineralcorticoidi, una fascia poi interna che è la zona fascicolata che produce glucocorticoidi, cortisolo e quant’altro, e poi una zona interna a contatto con la midollare che secerne ormoni androgeni, estradiolo, quindi ormoni sessuali maschilli e femminili. Questa organizzazione quindi è complessa tridimensionale sia strutturalmente che in termini funzionali. E tutti i tentativi fatti di studiare la secrezione per esempio solo della corticale o midollare mettendo in vitro le une e le altre, sono state sempre poco funzionali perché mancava la tridimensionalità, e mancava anche la componente dell’origine embrionale che derivano infatti da origini diverse, quindi per studiare la funzione è necessario ottenere una struttura tridimensionale ricreando tale struttura. Si pensa allora di usare cellule derivanti da materiale fetale, ottenuti da aborti volontari per esempio per cui abbiamo un sistema in cui si provoca aborto ottenendo materiale frammentario aspirando e questo significa che questo materiale ottenuto è assimilabile a una sorta di prelievo bioptico. Da questo materiale si recupera la ghiandola surrenale, disgregandola e ottenendo una serie di preparazioni cellulari eterogenee con cellule della corteccia, della midollare, vascolari e quant’altro. Era quindi importante ritrovare le varie componenti facendo western blot e analizzando l’espressione di vari marcatori. Quello che si mantiene è la funzionalità, mentre si perde la tridimensionalità, ma vediamo che spontaneamente in vitro queste cellule riacquistano questa tridimensionalità, e possiamo andare a vedere che si mantiene quell’organizzazione corticale e midollare, riproducendo in vitro quella tridimensionalità tipica che invece abbiamo in vivo. E se vediamo le caratteristiche morfologiche con analisi immuno-istochimica, possiamo vedere che anche la morfologia si mantiene. Quindi anche i rapporti spaziali tra le cellule sono perfettamente mantenuti, ed è uno degli aspetti fondamentali dell’uso degli organoidi, ovvero la possibilità di mantenere questa struttura 3D che rispecchi quella dell’organo di partenza. E in realtà questi organoidi li possiamo generare o dalle ESC, ovvero partendo da cellule staminali ottenute da blastocisti, oppure cellule IPSC, quindi cellule differenziate che de-differenziamo e quindi sono pluripotenti, e in questo modo andiamo a ricreare questi organoidi in vitro.

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Per concludere quindi gli scopi sono quelli di studiare per esempio farmaci verso una mutazione rigenerando l’organo in cui la mutazione si presenza, oppure vedere l’impatto del farmaco su quell’organo, oppure vedere componenti nella struttura tridimensionale da usare poi nella medicina rigenerativa, per esempio usando organoidi in vitro per la struttura cardiaca.

Organizzazione di una ricerca scientifica – Lez.3, 27.04

Detto questo vediamo come si organizza a questo punto una ricerca scientifica. Il metodo scientifico lo dobbiamo a Galileo Galilei che ha messo nero su bianco quelle fasi per organizzare la problematica suscitata dall’analisi della natura o delle condizioni cliniche e osservazioni in generale, e l’ha strutturato in una serie di passaggi che permettono di progettare dei progetti di studio, quindi sono importanti per organizzare la ricerca, ma poi sono i punti essenziali per creare un progetto di studio.

Ha quindi standardizzato le esperienze di organizzazione dell’analisi del mondo circostante cercando di affrontare e risolvere una serie di problematiche, quindi si basa su:

1. Osservazione di un fenomeno, anche nel parlare delle differenze di ricerche, tutto nasce da un quesito che ci poniamo guardando l’ambiente che ci poniamo, nasce quindi sempre come risposta a una problematica che viene dal mondo naturale, quindi osservando il ricercatore procede al secondo punto,
2. Quesito, ovvero dalla sua esperienza si pone un quesito capendo le problematiche che richiedono una risposta concreta. Dall’avere allora organizzato un quesito, allora si passa a formulare