Metodi fisici in chimica organica: spettroscopia NMR, IR, UV-Vis e spettrometria di massa applicate a composti organici

Spettroscopia NMR

2019-2020 Claudio Di Santillo Francesca Ferraro

Metodi spettroscopici per l’identificazione di composti organici

Identificare un composto partendo dalle sue caratteristiche spettroscopiche o non per analizzare la posizione dei sostituenti, i legami formati e le proprietà stereochimiche, per vedere se ci sono enantiomeri/diastereoisomeri ecc...

Per analizzare C e H nelle molecole si usava l’analisi per combustione, per capire cioè quanti C, O e H erano presenti sulla molecola attraverso una combustione.

Ci sono diverse tecniche spettroscopiche:

• Spettroscopia NMR.
• Spettroscopia IR: per capire quali gruppi funzionali sono presenti.
• Spettroscopia UV-visibile.
• Spettrometria di massa: per capire il peso molecolare, dà un’informazione minimale.

La spettrometria di massa è una tecnica distruttiva, non permette cioè di recuperare il campione dopo l’analisi anche se serve pochissimo campione. Le altre tecniche sono spettroscopiche, utilizzano la luce, cioè studiano i fenomeni che comportano lo scambio di energia tra radiazione e materia. Tutte le spettroscopie si possono riassumere col fatto che da uno stato ad energia più bassa si va a uno stato di energia più alto. Nelle varie spettroscopie cambia il fenomeno fisico al quale corrispondono questi livelli: l’NMR riguarda l’inversione di spin, l’IR lo stato vibrazionale e rotazionale della molecola.

→ In una molecola le forme di energia sono quantizzate. Quando una molecola è esposta a radiazioni E.M. si creano le condizioni per l’assorbimento e la transizione da un livello energetico ΔE superiore solo se l’energia hν del fotone è esattamente uguale alla differenza di energia tra i livelli implicati nella transizione ciò vale per tutte le spettroscopie:

ΔE = hν

¹H NMR: utilizziamo basse energie siamo nel campo delle onde radio con conseguente inversione di spin del nucleo.

IR: utilizziamo energie più alte affinché avvenga una transizione tra livelli energetici vibrazionali i protagonisti sono le vibrazioni delle molecole.

Uv-visibile: utilizziamo energia ancora più alta affinché avvenga una transizione elettronica i protagonisti sono gli e-.

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Spettroscopia NMR

Spettroscopia NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Si fa per capire di che molecola si tratta, si può fare sia del nucleo dell’H sia del C.

Si basa sulla risonanza cioè irraggiando un nucleo con un campo magnetico otterrò una risposta rappresentata dallo spettro quindi il nostro composto “risuona”.

La spettroscopia NMR si basa sulla misura dell’assorbimento nella regione delle radiofrequenze da parte di determinati nuclei. Alcuni nuclei possiedono un momento di spin e un momento magnetico. Di conseguenza la loro esposizione ad un campo magnetico dovrebbe portare allo splitting dei loro livelli energetici.

Pauli vide che inserendo un elemento all’interno di un campo magnetico, aumentava il numero delle righe nel suo spettro atomico, mediante un fenomeno di suddivisione di queste. Capì quindi che il campo magnetico influenzava lo spettro suddividendo le sue righe e successivamente suggerì che i nuclei avessero un momento di spin e un momento magnetico. Studi successivi spiegarono che alcuni nuclei, anche se non tutti, riescono ad assorbire determinate frequenze elettromagnetiche.

La NMR oltre che permettere l’identificazione di sostanze incognite permette di conoscere la cinetica di una reazione, l’analisi della sintesi opportuna ma viene anche usata in medicina risonanza magnetica nucleare.

La NMR è dunque quella tecnica per cui determinati nuclei dotati di momento magnetico di spin quando sono immersi in un campo magnetico sono in grado di assorbire una radiofrequenza. La radiofrequenza che io do è proprio quell’energia necessaria per passare tra due stadi, i due stadi sono due livelli energetici che sono stati indotti proprio dalla presenza del campo magnetico esterno. Ecco perché Pauli aveva visto che le righe dello spettro aumentavano quando l’elemento era immerso in un campo magnetico!!

La radiofrequenza è assorbita dal nucleo, permettendo un’eccitazione di stati energetici INDOTTI, GENERATI dalla presenza di un campo magnetico, fondamentale differenza con le altre spettroscopie che invece sfruttano due stadi che esistono già! Es stati vibrazionali/rotazionali o HOMO e LUMO sono stati che esistono a prescindere da qualunque intervento esterno.

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare NMR è una tecnica analitica molto potente che permette di ottenere dettagliate informazioni sulla struttura molecolare dei composti in esame. La spettroscopia NMR misura l'assorbimento di radiazione elettromagnetica in molecole immerse in un forte campo magnetico. Questo assorbimento avviene ad opera dei nuclei di particolari atomi tipicamente ¹H o ¹³C. Quindi con l'NMR si esaminano direttamente i nuclei atomici e non gli elettroni. Ogni informazione sull'intorno chimico viene dedotta osservando il comportamento dei nuclei atomici.

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Spin nucleare

Sono osservabili all'NMR solo i nuclei che hanno un momento magnetico nucleare di spin, e che quindi si comportano come l'ago di una bussola che si può orientare in un campo magnetico applicato. Il momento magnetico nucleare di spin μ è dato dalla relazione μ = γIh/2π dove γ è il rapporto giromagnetico, I è il numero quantico di spin nucleare, h è la costante di Planck. Lo spin nucleare viene prodotto dalle particelle che costituiscono il nucleo, protoni e neutroni. Queste si comportano come se fossero in rotazione spin attorno al loro asse, e hanno spin 1/2.

In molti atomi come nel ¹²C gli spin sono tutti appaiati, uno in opposizione all'altro e quindi si annullano reciprocamente e il nucleo atomico ha uno spin risultante I uguale a zero. In alcuni atomi, però, come in ¹H e in ¹³C il nucleo possiede uno spin risultante I diverso da zero. Le regole per determinare lo spin nucleare si possono così riassumere:

• Rientrano nel primo caso ¹²C e ¹⁶O che hanno I = 0 e quindi non hanno momento magnetico di spin e non sono osservabili all'NMR.
• Rientrano nel secondo caso ¹H, ¹⁹F, ¹³C, ³¹P e ¹⁵N che hanno I = 1/2 e quindi sono osservabili all'NMR.
• Rientrano nel terzo caso ²H e ¹⁴N che hanno I = 1 e quindi anche questi sono osservabili all'NMR.

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Livelli energetici in un campo magnetico

Quando un nucleo dotato di spin viene immerso in un campo magnetico, si comporta come l’ago di una bussola ed è sottoposto ad una coppia di forze che fanno allineare il suo momento magnetico μ al campo magnetico esterno B₀. Dato però che il nucleo oscilla come una trottola, il suo momento magnetico non può essere veramente allineato, ma è allineata la sua proiezione il cui valore è governato dal numero quantico m che può assumere i valori da -I a +I con incrementi di una unità e quindi può assumere 2I + 1 valori diversi.

Per esempio, un nucleo con spin ½ come ¹H può avere solo due versi sull’asse B₀: m = -1/2 discorde e m = +1/2 concorde. Un nucleo con spin 1 come deuterio ²H può avere tre orientazioni con m = -1, 0, +1.

Consideriamo ora il caso più semplice, quello con spin ½ di ¹H: i due stati possibili del nucleo non hanno la stessa energia, ma lo stato con m: +1/2 allineato al campo si trova ad energia leggermente minore di quello con m: -1/2 opposto al campo.

Come si vede nella figura, il momento magnetico nucleare μ non è perfettamente allineato col campo, ma continua ad oscillare attorno al campo magnetico applicato B₀ compiendo un moto di precessione simile a quello di una trottola.

Il moto di precessione dei momenti magnetici nucleari avviene con una frequenza proporzionale alla differenza di energia tra i due livelli detta frequenza di Larmor data dalla formula:

ν = ΔE/h = γB₀/2π

dove γ è il rapporto giromagnetico che dipende dal nucleo in esame. All’aumentare del campo applicato B₀, aumenta la frequenza di Larmor e quindi aumenta la differenza di energia tra i due livelli. Poiché la differenza di energia tra i due livelli è piccolissima, dell'ordine di 9 10^-6 kcal mol^-1, la popolazione di nuclei nei due stati è praticamente identica con una piccolissima prevalenza per lo stato a bassa energia concorde con il campo. Nel caso dei nuclei di idrogeno ¹H, a temperatura ambiente, in un campo magnetico di 1,41 Tesla, la frequenza è ν = 60 MHz e abbiamo un nucleo in più nello stato di bassa energia ogni duecento-mila nuclei, mentre in un campo di 7,05 Tesla, la frequenza è ν = 300 MHz e abbiamo 5 nuclei in più nello stato di bassa energia ogni duecentomila nuclei.

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Eppure, sono proprio questi pochi nuclei in eccesso allineati con il campo magnetico B₀ quelli che permettono di generare il segnale NMR.

Si noti che in un campo magnetico 5 volte più intenso 7,05 T c’è una differenza di energia tra i livelli 5 volte maggiore, quindi una frequenza di Larmor 300 MHz 5 volte maggiore, un numero di nuclei in più allineati con il campo 5 volte maggiore e quindi l’analisi ¹HNMR ha una sensibilità e una risoluzione come vedremo più avanti 5 volte maggiori.

Assorbimento di energia

Se il campione viene irradiato con una radiazione elettromagnetica di frequenza uguale alla frequenza di Larmor, ci sarà una interazione della componente magnetica della radiazione con i momenti magnetici nucleari anche questi oscillanti alla frequenza di Larmor. L'energia della radiazione potrà così essere trasferita ai nuclei. Ogni assorbimento di radiazione comporta un cambiamento di orientazione dello spin nucleare che ruoterà da allineato con il campo ad opposto al campo. Quando si verifica questa transizione di spin, si dice che i nuclei sono in risonanza con la radiazione applicata, da qui il nome di Risonanza Magnetica Nucleare, NMR.

Anche nello stato di massima eccitazione, la popolazione dei nuclei nei due livelli permessi sarà circa uguale, data la piccolissima differenza di energia tra i livelli. Lo stato eccitato sarà solo leggermente più popolato di quello fondamentale con un rapporto di popolazioni invertito, cioè, in un campo di 7.05 Tesla 300MHz per ¹H ci potranno essere 5 nuclei in più nello stato di alta energia ogni duecentomila nuclei.

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Produzione del segnale NMR

Nei primi strumenti NMR l’analisi veniva eseguita irradiando il campione, immerso nel campo magnetico B₀, con un fascio di onde radio di frequenza via via crescente in modo da eccitare in sequenza tutti i nuclei in esame e quindi veniva registrata l’entità della radiazione assorbita. Questa tecnica, però, risulta troppo lenta e non è più utilizzata.

Negli strumenti moderni FT-NMR il segnale viene generato con il metodo ad impulso e la trasformata di Fourier. Con questa tecnica tutti i nuclei di una specie vengono eccitati contemporaneamente da un impulso di radiofrequenza che contiene tutto l’intervallo di frequenze necessario, i dati vengono poi elaborati al computer con la tecnica della trasformata di Fourier.

Per capire come l’impulso a radiofrequenza interagisce con i nuclei in esame, dobbiamo introdurre un vettore chiamato Magnetizzazione Macroscopica M₀ che è la risultante di tutti i momenti magnetici nucleari. Dato che esiste un leggero eccesso di nuclei che si trovano allineati col campo magnetico B₀, il vettore M₀ è piccolo e allineato col campo. Chiamiamo asse z questa direzione. Se ora il campione viene irradiato lungo l’asse x con un impulso di radiofrequenza che contiene anche la frequenza di Larmor dei nuclei in esame ad es. ¹H, questi assorbono energia e subiscono una transizione di spin. Si osserva che il vettore Magnetizzazione Macroscopica M₀ ruota allontanandosi dall’asse z per avvicinarsi al piano xy e inizia un moto di precessione attorno all’asse z.

A questo punto si interrompe l’impulso di radiofrequenza emesso dall’oscillatore B1 lungo l’asse x, ma i nuclei eccitati continuano ad emettere per qualche istante un debole segnale di radiofrequenza che si spegne nel tempo, una specie di eco del segnale assorbito. Per registrare questo segnale entra in funzione un circuito ricevente B2 posto lungo l’asse y che ha lo scopo di misurare l’oscillazione della componente y del vettore M.

La situazione assomiglia a quando, dopo aver gridato di fronte ad una parete rocciosa, restiamo in silenzio per ascoltare l’eco. L’energia assorbita dai nuclei viene lentamente ceduta come calore agli atomi vicini a causa di fenomeni di rilassamento spin-reticolo con i dipoli delle molecole circostanti che influenzano la componente Mz, e fenomeni di rilassamento spin-spin con i nuclei di idrogeno vicini che influenzano la componente My. A causa di questa dissipazione di energia, il vettore M, compiendo delle spirali di precessione attorno all’asse z, si riporta al valore iniziale Mo, posizione per la quale la componente My è nulla.

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Il tempo necessario perché la magnetizzazione Mz venga recuperata per il 66% è detto tempo di rilassamento T1, ed è di circa un secondo. Nell’indagine NMR in medicina, il tempo di rilassamento spin-reticolo T1, è indicativo del tessuto nel quale sono immersi gli idrogeni in esame. La durata t(i) dell’impulso di radiofrequenza deve essere determinata con precisione per produrre un forte segnale NMR. Se t(i) è tale da piegare Mo di 90°, allora si produce il vettore My massimo. In genere t(i) è di alcuni microsecondi.

Il segnale raccolto è un segnale oscillante con frequenza ν, la frequenza di Larmor del nucleo in esame, che si smorza nel tempo e che viene detto FID Free Induction Decay, libero decadimento dell’induzione. In figura è illustrato il FID del CH₃I per l’atomo di idrogeno.

Dato che nella molecola CH₃I tre idrogeni sono tutti equivalenti tra di loro, hanno tutti la stessa frequenza di risonanza. Nel grafico questa frequenza ν è facilmente individuabile dato che la lunghezza d'onda nel FID, cioè la distanza tra due creste successive, rappresenta il periodo T dell’onda emessa dagli idrogeni e quindi la frequenza ν si ottiene dalla relazione:

A partire da un grafico in funzione del tempo, il FID, si ottiene così un nuovo grafico in funzione delle frequenze, chiamato spettro NMR, che mostra la frequenza assorbita e poi emessa dagli atomi di idrogeno nella molecola CH₃I:

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Se il campione contiene nuclei con differenti frequenze di risonanza, questi vengono tutti eccitati contemporaneamente dall’impulso di radiofrequenza e quindi il segnale FID raccolto è una curva complessa, chiamata interferogramma, data dalla combinazione di più FID semplici, uno per ogni frequenza assorbita dai nuclei.

Per poter risalire alle singole frequenze che, combinandosi tra loro, hanno generato il tracciato FID complesso, è necessario applicare una procedura matematica, detta trasformata di Fourier, che permette di passare dal grafico in funzione del tempo, il FID, al grafico in funzione delle frequenze, lo spettro NMR.

Come abbiamo visto esistono due tipi di rilassamento ma questi sono molto paragonabili, soprattutto in un solvente liquido. Dal principio di indeterminazione di Heisenberg, considerando anche che a nuclei diversi sono associati tempi di rilassamento diversi, T1 e T2 sono paragonabili in quanto, essendo tempi relativamente lunghi, avranno un’incertezza nell’energia praticamente trascurabile.

Se ho un tempo breve di permanenza, l’incertezza sull’energia frequenza è elevata. Viceversa, rimanendo più a lungo in quegli stati, c’è meno incertezza sul ΔE.

La differenza dei tempi in base ai nuclei ci permette di sapere quando inviare nuovamente un impulso essendo sicuri che i nuclei prima eccitati, siano tutti rilassati.

Preparazione del campione

Per preparare il campione quest’ultimo si deve sciogliere in un solvente che non ha protoni. Questo perché altrimenti nello spettro vedremmo solo il solvente, essendo presente in quantità, molto maggiore.

→ Viene usato il deuterio tipo cloroformio deuterato che non compare nella finestra di analisi del protone; tuttavia accade che non si riesce nella realtà a deuterare completamente il solvente, quindi è opportuno conoscere le frequenze di assorbimento dei solventi come standard degli spettri, prendendoli come riferimenti da cui far partire la nostra analisi. Compare praticamente sempre anche lo spettro dell’acqua data l’umidità presente nel campione e nella macchina.

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In conclusione, l’NMR copre un intervallo di frequenza molto breve tra 10⁸ e 10¹⁰ ma, in questo piccolo intervallo di frequenza, riusciamo a identificare dal tipo di protone nume