Metodi di laboratorio

Campionamento

Campionamento: vedi manuali x la gestione e la diagnostica delle malattie infettive di origine animale sul Sito del O.I.E (Organizzazione internazionale delle Epizoozie).

• 1) Scelta di un campione rappresentativo: in base al tropismo del patogeno verso i diversi tessuti, es. x malattie che interessano l’App respiratorio tamponi nasali; lavaggi bronco-alveolari con tamponi salini; prelievi tissutali post-mortem. Es. x malattie che interessano l’App gastroenterico campione fecale; prelievi tissutali post-mortem.
• 2) Prelievo in sicurezza: utilizzo di Dispositivi di protezione individuale DPI (camice; guanti; mascherine); asettico (x evitare cross-contaminazione tra campioni); se animale vivo misure di contenimento.
• 3) Identificazione del campione: utilizzo fogli di accompagnamento x identificare operatore + tipo di campione + analisi previste.
• 4) Trasporto del campione: nel minor tempo possibile; a T di conservazione variabili in base al campione. X campioni liquidi (più stabili), accorgimenti: no diluizioni; appositi contenitori o trasporto in terreno di trasporto colturale (con aggiunta di antibiotico x evitare la contaminazione batterica o aggiunta di proteine) o trasporto con tamponi salini (PDS) x evitare alterazioni di Ph.

Tipologie di campione

Campioni dalle vie aeree superficiali/profonde

Campioni dalle vie aeree superficiali/profonde: utilizzo: tamponi faringei.

Raschiati da croste/processi infiammatori cutanei intensi

Raschiati da croste/processi infiammatori cutanei intensi: x indagini sulla presenza di parassiti/funghi/batteri (NB: i batteri potrebbero NON essere l’agente primario, ma l’agente secondario).

• 1- Detersione + disinfezione della zona cutanea d’interesse.
• 2- Raschiamento dei bordi della zona colpita = delicatamente con una lama (es. bisturi sterile), prelevando pelo e cute fino al sanguinamento (circa 2 g).
• 3- Differenziamento del campione = mettendolo su un vetrino.

Prelievo sanguigno

Prelievo sanguigno: diagnostica diretta e indiretta (soprattutto siero, essendo ricco di Ac). La sede del prelievo varia in base alla specie, con o senza l’utilizzo di anticoagulante.

Campione latte

Campione latte: diagnostica diretta e indiretta x indagini sul singolo animale/di stalla per individuazione di mastiti cliniche/subcliniche.

• 1- Detersione del capezzolo.
• 2- Prelievo latte = 1 per ogni capezzolo (eliminando i primi getti di latte); in provetta sterile (una per ogni capezzolo).
• 3- Seminare (semina x striscio) a partire dal latte di ogni provetta su piastra (suddivisa in quattro quadranti che rappresentano i quattro quarti della mammella).
• 4- In caso di positività si parte dal campione di latte corrispondente al quadrante interessato e si va a fare una semina sui quattro quadranti.

Campione fecale

Campione fecale: soprattutto x patogeni che interessano l’App gastroenterico. “Campione sporco” (anche se prelevato in sterilità, risulta essere estremamente contaminato). Conservazione: congelamento.

• 1- Campione omogenato/frullato all’interno di soluzioni saline contenenti antibiotici.
• 2- Chiarificazione mediante centrifugazione: rimozione dei detriti maggiori + pt corpuscolata + batteri.

Altri campioni

Campione urinario.

Campione salivare.

Campione del liquido cerebrospinale

Campione del liquido cerebrospinale: x diagnosi di meningite.

• 1- Disinfezione del punto di iniezione (x evitare la contaminazione con sangue).
• 2- Prelievo liquido = tramite siringa sterile; in una provetta con anticoagulante.
• 3- Semina del liquor.

NB: il liquor è trasparente e quindi un’eventuale torbidità può già portare al sospetto che sia poi positivo dal punto di vista batterico.

Lavaggio tracheobronchiale

• 1- Sedazione del soggetto.
• 2- Lavaggio tracheobronchiale (NB: è necessario eseguirlo in profondità, a causa dell’elevata contaminazione batterica delle vie aeree superiori) = utilizzando una soluzione salina sterile isotermica; in provetta.
• 3- Centrifugazione del campione.
• 3- Semina del lavaggio tracheo-bronchiale sul terreno in piastra = SOLO in determinate occasioni (es. scopo di ricerca); in aerobiosi/anaerobiosi.

Campioni post-mortem

Campioni post-mortem.

Diagnostica diretta

Diagnostica diretta cerca antigeni (Ag). NB: soprattutto x virus.

I) Tecniche istopatologiche

I) Tecniche istopatologiche: x lesioni tissutali virali caratteristiche nell’ordine di risoluzione del M.O.

• Le più antiche.
• Basata su: identificazione dei corpi inclusi (= accumuli di proteine virali).
• Materiale: a- M.O x evidenziare aree di intensa attività replicativa; b- tecniche di fissazione + colorazione cellule/tessuti.
• Vantaggi: specifica.
• Svantaggi: poco sensibili.
• Limiti: utilizzabile solo su campioni istologici da infezioni con quadri istopatologici chiari.

Es. diagnosi della rabbia: caratteristiche istologiche: inclusioni rotonde/ovali (0,25/27 micrometri) nel citoplasma delle cell nervose (soprattutto cell piramidali del Corno di Ammone; cell del Purkinje del cervelletto; cell dei gangli; neuroni dell Gh salivari/della lingua).

Utilizzate: colorazioni di Mann’s / Giemsa / Sellers (corpi de Negri color magenta con all’int piccoli granuli blu scuro) + colorazioni di eosina (aree acidofile di intensa attività di replicazione virale).

II) Isolamento virale

II) Isolamento virale: x identificazione + caratterizzazione di un ceppo virale (permette la replicazione di un virus al di fuori del soggetto infetto).

• Materiale: a- animali da sperimentazione; b- uova embrionate; c- colture cellulari = su micropiastre con pozzetti (fino a 96) o su fiasche con diverse superfici; semina su substrati cellulari permissivi (monostrato semiconfluenti/cellule di passaggio) in presenza del virus.
• Effetto citopatico CPE: può portare alla caratterizzazione del ceppo virale.
• Se CPE + indirizza sulle prove di identificazione** (ME; IF; emoagglutinazione; Agid titolazione dell’emoagglutinazione; SN; tecniche biomolecolari).
• Sx: effetto citolitico.
• Dx: CPE evidenziato da Ac monoclonale marcato con perossidasi su un substrato cromogeno (tiaminobenzidina) o DAB.
• Se CPE - possibile errore nell’isolamento; bassa qualità di virus; presenza di ceppi NON patogeni.

*Tipi di CPE:

• a) Lisi cellulare = disorganizzazione del tappeto cellulare + rigonfiamento cellulare + > rifrangenza delle cellule.
• b) Formazione di sincizi = formazione di cellule giganti multinucleate.
• c) Vacuolizzazione = formazione di vacuoli a liv citoplasmatico/nucleare.
• d) Formazione di corpi inclusi = ammassi di nucleocapside/virioni maturi/proteine/Ac nucleici basofili.

Vantaggi: maggiore sensibilità (rispetto a tecniche istopatologiche).

III) Ricerca di Ag virali specifici

III) Ricerca di Ag virali specifici: x virus che NON danno CPE.

Se Ag precoci: fasi iniziali della replicazione. Se Ag tardivi: proteine strutturali.

Basata su: riconoscimento (da parte di Ac monoclonali marcati*) det porz proteiche “epitopi” del virione nella soluzione o sul monostrato cell fissato in esame.

* Ac monoclonali “marcati” = Ac derivati da un unico clone linfocitario e coniugati chimicamente con un’altra molecola di fluorocoloro ad una det lunghezza d’onda produce fluorescenza; di enzima (es. perossidasi) in presenza di un det substrato (es. diaminobenzidina) produce reazione colorimetrica.

Materiale:

• NB: nei laboratori o liberi professionisti: test rapidi (es. ELISA cattura) = evidenziano il legame tra Ac clonale—epitopo del patogeno.
• Nei laboratori (solo x virus emoagglutinanti): test di emoagglutinazione* = evidenziano la capacità del virus di emoagglutinare i g.r, formando un reticolo tridimensionale.

* NB: lo stesso approccio applicato in coltura cellulare prende il nome di “emoadsorbimento” x virus emoagglutinanti NON citopatogeni.

Svolgimento:

• 1- Aggiungere mAc di cattura nei pozzetti: si legano alla plastica, esponendo la frazione variabile (che legherà l’Ag).
• 2- Aggiungere campione in esame (necessariamente solubile) nei pozzetti.
• 2a- Se presenza del virus (Ag) legame tra frazione variabile dell’mAc—epitopo virale.
• 2b- Se assenza del virus (Ag) no legame.
• 3a- Aggiungere mAc coniugato (con enzima) nei pozzetti: legame tra frazione variabile dell’mAc—epitopo virale---mAc coniugato.
• 4a- Aggiungere substrato: reazione colorimetrica.

Vantaggi: buona sensibilità; buona specificità; evidenzia Ag anche se il virus NON è più in fase di replicazione/inattivo.

Svantaggi: necessità di un sospetto preciso dell’eziologia della malattia; Ac monoclonali NON sono disponibili x tutti i virus; la negatività non esclude l’eziologia virale.

IV) Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici

IV) Tecniche di ibridazione degli acidi nucleici: x evidenziare la presenza di det sequenze.

“Southern blotting”: metodo che sfrutta una sonda marcata (piccolo frammento di DNA a catena singola complementare alla Seq target, visibile in fluorescenza/radioattività) per identificare la sequenza target d’interesse di DNA.

Svolgimento:

• 1. Elettroforesi su gel di agarosio/poliacrilammide: frammentazione DNA a doppio filamento.
• 2. Immersione (durata 15 min) del gel di agarosio/poliacrilammide in una soluzione alcalina (es. soluzione molto diluita di NaOH): rottura legami tra le basi azotate, frammenti di DNA a singolo filamento.
• 3. Copertura del gel di agarosio/poliacrilammide con una membrana di nitrocellulosa/di Nylon (a carica positiva +) + 1 pila di fogli assorbenti: la soluzione risale per capillarità verso i fogli, il DNA è trasportato dai sali e rimane adeso alla nitrocellulosa (“fotografato sulla nitrocellulosa”).
• 4. Incubazione (1h-1 notte) della membrana di nitrocellulosa in presenza di una sonda marcata complementare alla sequenza target d’interesse: fotografia.
• 5. Lettura della membrana di nitrocellulosa.

“Northern blotting”: metodo simile al Southern blotting, per identificare sequenze d’interesse di RNA (NB: molto utilizzata x studiare l’espressione genica).

• 1. Esposizione del RNA ad alte T: denaturazione RNA.
• 2. Elettroforesi su gel di agarosio/poliacrilammide in presenza di agenti denaturanti (es. formaldeide; formammide).
• 3. Utilizzando una sonda di DNA (o altri metodi): identificazione dell’RNA.

V) Biologia molecolare

V) Biologia molecolare: x identificare molecole di DNA batterico/virale all’interno del genoma dell’ospite.

Basata su: sull’amplificazione genica “PCR-endpoint”.

“Reazione a catena della Polimerasi PCR”: metodo che permette l’amplificazione del DNA bersaglio in milioni di copie x verificare correttamente la presenza del patogeno e la sua la vitalità (controllando presenza di RNA); x provare a caratterizzare al MAX il patogeno identificato.

Sono necessarie:

• a- DNA polimerasi DNA dipendente (termostabili, es. Taq polimerasi) = enzima polimerasi che crea una nuova catena di DNA partendo da una filamento originale.
• b- Templato/Seq target = Seq di riferimento (può essere una sequenza conservata o sequenza variabile).
• c- Primer (x 2) = piccole sequenza di DNA a singolo filamento (20 nucleotidi), che si posizionano ai margini dell’amplificato x delimitare l’amplificazione genica.
• d- Nucleotidi in forma trifosfata.
• e- MgCl2.
• f- Corrette condizioni di reazione.

Funzionamento:

• 1. Esposizione a T° = 96°C per un tempo relativamente breve: denaturazione del DNA, DNA a catena singola.
• 2. Abbassamento della T (“T di melting” = 5°C; se primer A-T = 2°C, se C-G = 4°C) permette legame tra primer—templato, creazione innesco della polimerasi: Annealig.
• 3. Aumento della T (T = 72°C, variabile in base all’enzima utilizzato): Taq polimerasi prolunga il primer incorporando i nucleotidi trifosfati inseriti dentro la soluzione. Allungamento (varia in base alla lungh del segmento da amplificare) (1K—5Kbp al min) fino al raggiungimento della fase di plateau, stop incremento dei prodotti.
• 4. Evidenziare il risultato sul gel di agarosio/acrilammide con un intercalante (solitamente fluorescente es. bromuro di etidio). Il risultato della PCR è rappresentato da una banda (situata a differente h in base alle taglie dei frammenti che filtrano).

Formula: Y (n) = qualità del templato x (1+efficienza di reazione)^n cicli. * n cicli = solitamente 30-40 cicli; durata tot = 1 h30min; efficienza di reazione = 0,7/0,8.

Applicazione: in genetica; in genomica; malattie infettive; trascrittomica.

Vantaggi: tecnica molto versatile; utilizzo di strumenti comuni; corrisponde al punto di partenza per successive analisi.

Svantaggi: elevata versatilità; elevata complessità; utilizzo di reagenti potenzialmente dannosi; identificazione mediata dal riconoscimento di una singola sequenza; sensibilità termica del campione.

Limiti: quantità primers; tipo di enzima; attività della Taq polimerasi; Reanneling dei filamenti.

RICORDA!: la PCR è applicabile sia a DNA che a RNA (MA l’RNA può essere amplificato SOLO se prima retrotrascritto in cDNA).

• a) Amplificazione One-Step RT-PCR (utilizza mix di PCR = enzima retrotrascrive l’RNA in cDNA + DNA polimerasi DNA dipendente).
• b) Amplificazione Two-Step RT-PCR (utilizza prima enzima retrotrascrive l’RNA in cDNA, e in seguito DNA polimerasi DNA dipendente).

NB: la Real time PCR monitora l’amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR (utilizzando reagenti aggiuntivi: intercalanti* o sonde marcate**) alla fine di ogni ciclo fornisce info sulla n di copie di templato: segnale cumulativo.

*Con intercalante: es. CYBER-green (esattamente come il bromuro di etidio) = molecola fluorescente NON specifica perché si lega e si intercala a qualsiasi doppia elica. Raggi UV eccitano il pozzetto, ogni intercalante emetta una fluorescenza (economico, poco specifico).

**Con sonda marcata: legata al gene target, ha 2 molecole (1 Reporter se eccitato emette fluorescenza; 1 Quencer/Estintore assorbe fluorescenza), nel momento in cui la PCR incontra la sonda la degrada (attività esonucleasica) allontana le 2 molecole, Reporter libero se eccitato riesce ad emettere fluorescenza (costoso, molto specifico).

Altre applicazioni della PCR:

• ) PCR MULTIPLEX = soluzione contenente diverse copie di primer, per poter avere più target contemporaneamente (svantaggio: queste PCR sono molto complesse da ottimizzare) x ricerca contemporanea di diverse specie animali all’interno del medesimo mangime.
• ) Random Amplification of Poymorphic DNA RAPD-PCR = tipologia di PCR che utilizza primers aspecifici e brevi (8-12 nucleotidi random, a seq casuale), che a seconda di dove si legano produrranno PCR di lunghezza variabile in cui i segmenti di DNA amplificati sono scelti casualmente x caratterizzare/riconoscere batteri.

Es. 2 ceppi batterici quasi identici, ma che differenziano per alcune pt del genoma.

• 1. n primer brevi aspecifici si legano alle porzioni comuni dei 2 genomi batterici (mentre avranno difficoltà a legarsi alle pt diverse, quindi o non si legano a si legano in posizioni diverse).
• 2. Reazione di amplificazione usando come stampo un lungo tratto di DNA genomico: amplificazione produzione frammenti.
• 3. Interpretazione dei frammenti: approssimazione di un profilo semi-individuale (“profilo di restrizione” n tagli e n bande corrispondenti) dell’organismo in analisi.

Numero possibile di siti (N) = grandezza genoma (G) x probabilità di ottenere casualmente la sequenza scelta del primer (p^k).

NB: se NON si desidera lavorare su tutto il genoma utilizzare enzima di restrizione su un singolo frammento dell’amplificato. Se l’enzima trova il sito di taglio: taglio amplificato, formazione di 2 bande. Se l’enzima NON trova il sito di taglio: amplificato rimane integro.

PERLA! Inizialmente grazie all’amplificazione genica (con PCR) era possibile il sequenziamento dell’intero genoma, odiernamente si utilizzano strumenti di sequenziamento di nuova generazione.

VI) Microscopia elettronica

VI) Microscopia elettronica.

VII) Test ELISA diretto/cattura/sandwich

VII) Test ELISA diretto/cattura/sandwich (metodo più in utilizzato; “Gold standard mondiale”) x tipizzazione + identificazione di virus che non danno CPE.

Materiale: piastra a 96 pozzetti; Ac monoclonali/policlonali di cattura; Ac monoclonali marcati secondari (di rilevamento); campione solubilizzato (sangue; saliva; tessuto lisato; liq delle colture cellulari).

Svolgimento:

• 1- Aggiungere Ac monoclonali/policlonali di cattura al pozzetto che si legheranno al fondo del pozzetto.
• 2- Aggiungere campione al pozzetto.
• 2a- Se Ac monoclonale/policlonale di cattura—Ag campione +.
• 2b- Se Ac monoclonale/policlonale di cattura NON lega Ag campione -.
• 3- Incubazione.
• 4- Lavaggio: rimangono solamente gli Ag che sono stati legati.
• 5- Aggiungere Ac monoclonali secondari: legame Ac monoclonale secondario—Ag—Ac primario di cattura.
• 6- Innesco reazione fluorimetrica o colorimetrica.

Diagnostica indiretta

Diagnostica indiretta cerca anticorpi (Ac), effetto del passaggio di un Ag (> pt in sangue, poco in latte).

Con l’utilizzo di substrati biologici:

I) Prove di precipitazione

I) Prove di precipitazione: (emoprecipitazione) Ag in soluzione.

Basata su: formazione del reticolo di Marrack. Mettere a contatto diluizioni scalari di siero --- conc standard di Ag in soluzione; se formazione legami Ac—Ag formazione reticolo di Marrack, immunodiffusione* o immunoelettroforesi** evidenziano legame Ac—Ag.

Condizioni necessarie:

• a. Presenza di elettroliti.
• b. Corretta concentrazione di Ac e Ag (1 stesso Ac farà da ponte tra 2 differenti Ag, e 1 stesso Ag farà da ponte tra 2 differenti Ac). NB: misurando il titolo precipitante valutazione della quantità di Ac e Ag.

*Immunodiffusione in gel di agar: (all’interno di una capsula Petri) disposizione esagonale e 1 centrale di pozzetti scavati nell’agar (nel pozzetto centrale Ag; nei pozzetti ai vertici dell’esagono sieri in esame).

Sia gli Ag che gli Ac migrano centrifugamente rispetto al pozzetto in cui erano; se vi sono Ac specifici all’interno del siero in esame in grado di riconoscere l’Ag precipitazione.

Vantaggi: elevate semplicità di esecuzione; costi minimi; durata 48h; valutabile ad occhio nudo.

Svantaggi: necessaria esperienza dell’operatore; sono testabili pochi cam