Medicina della riproduzione

Medicina della riproduzione

Csilla Krausz A.A. 2021/2022

Determinazione e differenziazione sessuale

Vediamo quindi come nasce l’embrione e come avviene la determinazione sessuale. Sappiamo che il sesso dipende da quale spermatozoo ha fecondato l’ovocita; infatti, ha 22 autosomi e 1 cromosoma sessuale e dipende se questo è un cromosoma X o cromosoma Y, e di conseguenza avremmo un embrione 46, XY per i maschi e 46, XX per la femmina. Una volta detto il sesso gonadico, quindi ovaio o testicolo, processo che viene detto come determinazione sessuale, questa gonade produce degli ormoni e sostanze che servono a differenziare i genitali. Avremmo allora la differenziazione sessuale che definisce quel sesso fenotipico.

Questo processo era intuitivo, infatti soggetti che avevano il cromosoma Y, nonostante per esempio 2 X erano maschi mentre soggetti con solo un cromosoma X (sindrome di Turner) erano sempre femmine. Nel 1990 venne trovato un gene nel cromosoma Y che lo chiamò SRY ed è quello che definisce la formazione del testicolo e trasmesso da padre a figlio quindi per via paterna.

Questo concetto di avere la determinazione sessuale è indipendente dagli ormoni, mentre sono coinvolti fattori di trascrizione, mentre la seconda parte, differenziazione sessuale, è dipendente da ormoni. Quindi nella vita fetale abbiamo la determinazione del sesso genetico che fa partire messaggi mediante fattori di trascrizione portando alla formazione del testicolo che ha delle cellule somatiche che a loro volta faranno degli ormoni.

Determinazione sessuale senza ormoni

Vediamo cosa succede durante la determinazione sessuale senza avere ormoni. Le prime proteine coinvolte sono la Map3K1 che attiva quei secondi messaggeri che si collocano nei promotori del gene SRY. Sappiamo che i fattori di trascrizione sono quelle proteine che attivano o inibiscono la trascrizione genica, posizionandosi nei promotori oppure che si trovano più lontani e che sono i così detti enhancer.

Quindi succede che abbiamo questo Mapk che attiva questi fattori di trascrizione che trascrivono il gene SRY, che a sua volta è un fattore di trascrizione che si lega nel gene Sox9; quindi, chiamiamo come master gene SRY che si trova nel cromosoma Y, ma è importantissimo anche Sox9 che sta non su Y ma su un autosoma. E questo gene è così importante, tanto che quando l’embrione è destinato a essere femmina, l’embrione XX produce dei fattori di trascrizione che vanno a posizionarsi nel promotore di Sox9 per bloccarlo; quindi, per avere una formazione di un normale ovaio, attivamente si deve reprimere Sox9, che invece viene espresso e up-regolato per produrre un testicolo normale. Sox9 a sua volta agisce su cellule di Leidigh e Sertoli e si forma infatti il testicolo.

Il cromosoma Y è il più piccolo del cromosoma umano e ha una regione che si chiama PAR (Regione Pseudo Autosomiale), e sappiamo che il cromosoma X e Y nell’evoluzione nascono da un paio di autosomi, che milioni di anni fa condividevano il contenuto genico. Quando poi è arrivato il gene SRY su uno dei due, è diventato il gene trasmissibile soltanto per via paterna e per una serie di eventi questi due cromosomi, che ora sono detti X e Y, non riuscivano a avere crossing over, che infatti sono solo tra cromosomi omologhi. È quindi rimasto questa regione PAR nel cromosoma Y che deriva da quando i due cromosomi sessuali erano autosomi.

Funzione di SRY e Sox9

Ed è molto importante ricordare che è a zona in cui ci sono geni che possono tuttora, nello spermatocita che fa la meiosi, e solo questa regione può dare crossing over tra X e Y, e subito sotto invece c’è il master gene SRY. Questo gene SRY è piccolissimo, codifica per 204aa, ha una parte centrale importantissima detta HMG-box che si lega al promotore del Sox9; quindi, è il dominio funzionale di questa proteina. Il ruolo di SRY, una volta attivato, è quindi quello di indurre trascrizione di Sox9, ma induce anche differenziazione delle cellule di Sertoli e della rete Testis che darà origine ai tubuli seminiferi.

Le cellule di Sertoli sono le prime cellule che poi si attuano come centro organizzativo che dirige la differenziazione dei vari tipi di cellule nel testicolo. Quindi, quando parliamo della determinazione sessuale, le due parole chiave sono che intanto questi fattori di trascrizione interagiscono, quindi diciamo interazione tra proteine, per far attivare i geni nei momenti e tempi giusti, e sono poi dose sensibili, ovvero si ha questa sensibilità in base alla concentrazione di queste proteine.

Quindi, per avere un testicolo funzionale il SRY up-regola parecchio Sox9 che si mantiene e a sua volta attiva altri fattori di trascrizione. Nella femmina per un ovaio corretto invece ci deve essere una repressione attiva del Sox9; quindi, diciamo che il livello basale prima della determinazione sessuale, non è corretto né per ovaio né per testicolo.

Quindi vedendo nel totale, possiamo vedere che i fattori pro-ovaio bloccano Sox9 e tutti i fattori trascrizionali pro-testicolari, e quindi c’è un continuo scontro tra fattori pro-ovaio e pro-testicolo, e pare che ci siano molti più fattori per formare il testicolo funzionante.

Possibili problemi nella determinazione sessuale

Cosa può andare male in tutto questo? Possiamo immaginare che abbiamo geni che ovviamente possono essere mutati, alterando questi fattori di trascrizione, portando a disturbi della determinazione sessuale. Quindi certamente c’è un enorme sinergismo tra i fattori di trascrizione che sono attivati e repressi in modo preciso e per semplificare, possiamo immaginare che per avere un maschio normale durante la formazione del testicolo i fattori testicolari devono prevalere, ma posso anche aver un individuo 46, XX maschio, detto sex reversal, ovvero geneticamente femmina ma fenotipicamente maschio. Potrebbe essere che si ha massimazione dei fattori testicolari in maniera anomala; quindi, c’è troppo di fattori testicolari per un dosaggio esagerato, oppure perché mancano i fattori ovarici che dovevano inibire i fattori testicolari.

Disordini della determinazione sessuale

L’altro scenario è la classica donna 46, XX in cui i fattori ovarici pesano di più, ma possiamo anche sempre avere femmine 46, XY che sono così perché magari c’è un aumento di dosaggio di fattori pro-ovarici, oppure mancano perché mutati, i fattori testicolari. Queste malattie si chiamano quindi disordini della determinazione sessuale, le cui cause sicuramente sono da attribuire in primis al gene SRY.

Quindi, torniamo al concetto detto prima per cui abbiamo il cromosoma Y che avere la regione PAR con sotto SRY, e PAR è la regione che dà crossing over con X. Siccome PAR e SRY sono attaccati, per errore, quello che viene detto crossing over ineguale, ovvero in cui si ha trascinamento di SRY con PAR e qui di si trascina SRY su X e Y rimane senza SRY, allora alla fine della meiosi errata avremo uno spermatozoo con SRY mancante del cromosoma Y, e quindi se questo spermatozoo senza SRY, sebbene sia Y, quando feconda l’ovocita non sarà in grado di formare testicolo e il fenotipo sessuale è femmina, ovviamente poi con gonade difettosa, ma sarà donna fenotipicamente.

D’altra parte però avremo anche lo spermatozoo con X arricchito di SRY che quando feconda l’ovocita farà determinare il testicolo e quindi nonostante il genotipo XX, genererà il fenotipo maschile. Nei maschi 46,XX in cui chiaramente c’è attivazione del pathway maschile, abbiamo allora 3 possibilità, nell’85% dei casi avviene per traslocazione di SRY su X, ma possiamo anche avere mutazione di geni attivati dopo SRY, come Sox9, e poi abbiamo anche un caso molto raro in cui abbiamo mutazioni in fattori di trascrizione che hanno il compito di bloccare la produzione di Sox9 e sono quelli che infatti devono far scendere il livello di trascrizione di Sox9, quindi si riducono i fattori della determinazione femminile.

Soggetti 46, XX e 46, XY

In genere il soggetto 46, XX è maschio a tutti gli effetti, in media ha un’altezza inferiore perché si pensa che ci siano altri fattori che determinano l’altezza superiore nei maschi. Nei casi invece 46, XY femmina potremmo pensare che manchi SRY, ma questo lo abbiamo solo in un 15% dei casi, per esempio invece possiamo avere problemi subito all’inizio, per esempio la Map3K1 nel 18% dei casi e quindi non si attiva la cascata che dovrebbe attivarsi con SRY, così come altri fattori, ma possiamo anche avere altre problematiche sempre con Sox9 a valle dell’SRY che può avere dosaggio minore, al contrario di prima del caso maschio XX, oppure posso aver un dosaggio aumentato dei fattori di trascrizione pro-ovaio.

Nel 40% dei casi invece non troviamo problemi a carico dei geni che codificano per fattori di trascrizione e quindi o c’è da scoprire nuovi geni, oppure si tratta di un problema riguardo invece la differenziazione sessuale, oppure la S. di Morris come resistenza a ogni tipo di androgeno.

Individuo 46, XY femmina

Allora a questo punto potremmo chiederci cosa succede se è in questo caso SRY mutato direttamente, quindi un individuo 46,XY femmina. Di solito si scoprono questi casi per infertilità o per amenorrea primaria; infatti, spesso si fa cariotipo e poi si scopre per esempio essere XY, e si fa solitamente la ricerca di SRY che potrebbe essere andato perso come abbiamo visto, ma se c’è andiamo a sequenziarlo e potremmo trovare eventuali mutazioni. Per esempio potremmo trovare mutazioni in quel dominio funzionale del tipo HMG-box, e si vede che problemi in questo sito fa sì che il legame sul promotore viene meno e quindi la proteina non riesce a fare il suo dovere.

Quindi questa ragazza ha amenorrea perché SRY non ha generato il testicolo ma allo stesso tempo non essendo XX la gonade non è del tutto formata e si parla di disgenesia gonadica e purtroppo in questi casi, poiché c’è tutto il cromosoma Y, abbiamo tutti gli altri geni di SRY, tra cui TSPY che è un oncogene e che in queste persone che hanno questa disgenesia gonadica, questo gene può generare quello che viene detto gonadoblastoma, un tumore maligno.

Importanza di Sox9

In particolare Sox9 è un gene espresso anche nella gonade indifferenziata e poi nelle cellule di Sertoli perché come si diceva, SRY sia come tale che come attivatore del Sox9, induce differenziazione delle Sertoli. Se si ha mutazione su Sox9, si ha implicazioni per il fatto che è importante non solo per formazione del testicolo, ma anche per la formazione di cartilagini e in caso di mutazione del tipo Loss of Function queste persone non solo hanno problemi di determinazione sessuale, ma abbiamo anche displasia campomelica in cui si ha scorretta formazione delle cartilagini.

Quindi, se abbiamo problemi su SRY tipicamente si ha problemi solo nelle gonadi, mentre su Sox9 abbiamo anche questi problemi maggiori.

WT1 e altre proteine

In realtà abbiamo anche un’altra proteina detta WT1 che ha una ventina di isoforme, tra cui una che contiene tre aminoacidi e una senza questi tre, e la cosa incredibile è che per avere una normale formazione del testicolo, c’è bisogno di trascrivere l’isoforma completa con il tripeptide, e quello che è interessante è che solamente aggiungendo 3aa si cambia il destino di quella gonade; infatti, ci sono persone che hanno l’isoforma senza questo tripeptide e quindi diventano XY femmine.

Inoltre, avevamo anche detto che per femmina XY abbiamo anche un altro caso, in cui si ha troppi fattori ovarici per la formazione di XY femmina e parliamo allora di DAX1, un inibitore forte nella produzione di Sox9, quando questo si attiva, e a quel punto si ferma il percorso verso il testicolo e si formano gonadi sempre non perfettamente differenziate ma fenotipicamente femmina con genotipo XY.

Fisiologia del testicolo

Andiamo allora adesso a vedere la fisiologia, mettendo che la persona ha SRY, Sox9 non è mutato, tutto è perfetto, senza esagerati fattori ovarici e si forma il testicolo funzionante, che ha due cellule, le cellule di Sertoli e le cellule di Leidigh, due cellule somatiche in cui le prime organizzano la struttura del testicolo producendo un fattore detto fattore antimulleriano (AMH), per cui ci sono le strutture dette dotti di Müller che non si devono sviluppare nel maschio, infatti il fattore AMH agisce proprio sui recettori di queste strutture impedendone la formazione.

Le cellule di Leidigh invece producono il testosterone e anche bINSL3 che è un peptide dove entrambi sono importanti per la differenziazione sessuale maschile. Ovviamente poi ci sono anche le cellule germinali che all’inizio sono dette primordiali che migrano nel testicolo, nella gonade indifferenziata e quando parte la determinazione sessuale, quindi diventa testicolo, queste cellule germinali primordiali diventeranno spermatogoni che sono le cellule germinali del maschio, mentre nelle femmine sono gli oogoni.

Quindi formato il testicolo, intorno alla 6/7 settimana si forma il testicolo che inizia a produrre gli ormoni che fanno sì che entro la 10 sett le strutture mulleriane spariscono, si sviluppano invece i dotti Wolfiani, si ha l’inizio della discesa dei testicoli e poi alla nascita si spera che siano già a livello scrotale. Tutto questo è orchestrato da testosterone, diidrotestosterone, fattore AMH e INLS3.

Le funzioni testicolari, in vita fetale serve alla differenziazione sessuale, mentre in vita adulta serve alla fertilità e alla produzione di testosterone, utile per i caratteri secondari, per la funzione sessuale, ma non solo che poi vedremo. E diciamo che la cellula di Leidigh è una fabbrica, pieni di mitocondri e strutture che sono utili a produrre gli steroidi a livello citosolico che porteranno alla formazione di testosterone e diidrotestosterone che ne è il derivato, e poi il INSL3.

Quindi fino alla 8 sett entrambi i feti hanno strutture iniziale dei dotti di Muller e dotti di Wolff ma quello che succede è che nel maschio i dotti di Wolff si sviluppano, dando origine all’epididimo, poi abbiamo il deferente che entra nel canale inguinale, passando dalla prostata, poi abbiamo le vescichette seminali e poi il liquido seminale esce dall’uretra. Le strutture Wolfiane quindi sono quelle maschili, mentre le strutture Mulleriane sono quelle femminili con il 3° superiore della vagina, utero e tube.

Mutazioni e fertilità

Abbiamo detto che le cellule di Sertoli producono il fattore AMH e quindi per generare una cellula di Sertoli devo attivare la cascata SRY e Sox9, allora se riprendiamo il caso della ragazza con mutazione di SRY, questa ragazza avrà l’utero perché questo testicolo che non sarà testicolo perché l’SRY è mutato, non può produrre AMH, allora una donna che ha questa situazione, si tolgono le gonadi disgenetiche, ma potrebbe avere figlio con ovodonazione, proprio perché l’utero è presente.

Facendo un richiamo alle conoscenze di biochimica, la steroidogenesi non avviene solo nel testicolo e ovaio, ma anche a livello del surrene, quell’organo che fa aldosterone, come mineralo-attivo per mantenere equilibrio salino nell’organismo, pressione, poi cortisone, importantissimo nella nostra vita perché è fondamentale per le attività vitali, e poi invece abbiamo quegli steroidi sessuali con estradiolo e estrogeni che derivano dagli androste-neidoni.

Funzione endocrina testicolare

Funzione endocrina testicolare - (lez.1.2) 13.04

Parliamo allora della funzione testicolare che abbiamo detto poter avere una funzione riproduttiva e endocrina, vediamo la funzione endocrina. L’asse ipotalamo ipofisi testicolo è quella che rappresenta la funzione della regolazione testicolare e abbiamo un ormone detto GnRH nell’ipofisi posteriore, mentre nell’anteriore abbiamo LH e FSH, detti ormone leutinizzante e follicolo stimolante, e sono nomi detti per la gonade femminile, ma nel maschio hanno lo stesso nome, e l’FSH agisce nei tubuli seminiferi, stimolando la cellula di Sertoli e a sua volta comunicherà con il centro mediante l’inibina B che è un peptide che segnala a carico dell’ipofisi dicendo se va tutto bene, per cui la sua quantità induce una corretta produzione di FSH, ma se in periferia c’è poca inibina B perché la cellula di Sertoli avverte problemi nel tubulo seminifero, se manca inbiina B aumenta l’FSH che quindi si vede come risponde con feedback negativo.

Invece l’LH agisce nelle cellule di Leidigh che producono testosterone e NLS3 e comunica mediante testosterone che a sua volta regola la produzione di LH in feedback negativo ancora una volta, ovvero se il testicolo non produce testosterone allora si alzano i livelli di LH e un altro fattore è anche mediante estradiolo perché anche il testosterone si trasforma nell’ipofisi in estradiolo perché esiste l’enzima dell’aromatasi che trasforma testosterone in estradiolo.

Allora abbiamo l’ipotalamo, ipofisi nella sella turgica, struttura cartilaginea non espansiva, in cui l’ipofisi ha una parte anteriore e una posteriore e ovviamente succede che il GnRH prodotto dall’ipofisi posteriore entra nell’anteriore a produrre gonadotropine, mentre gli ormoni dell’ipofisi posteriore sono poi direzionati nell’ipofisi posteriore che è un deposito piuttosto che produzione. Gli ormoni che ci interessano sono il GnRH che stimolano LH e FSH, ma abbiamo anche ormone della crescita, GHRH, poi abbiamo il TSH che ha ormone di rilascio per la tiroide, la prolattina che serve all’allattamento e abbiamo anche la ACTH che stimola il surrene. Noi ora ricordiamo ci serve l’asse ipotalamo-ipofisi-testicolo che ha come attori LH e FSH con comunicazione feedback negativo.

Prodotto finale: lo spermatozoo

Abbiamo allora detto le funzioni testicolari e iniziamo a parlare del prodotto finale, ovvero lo spermatozoo che ha tante caratteristiche particolari. Ovviamente, oltre all’asse ipotalamo ipofisi, nel testicolo abbiamo altri fattori paracrini e autocrini, ovvero in cui nel primo caso è un prodotto della cellula di Sertoli che agisce nelle cellule vicine, mentre autocrine è un segnale per cui il prodotto di una cellula stimola quella cellula stessa. Noi sappiamo che per formare gli spermatozoi si devono attivare più di 1000 geni, ma anche 3000/4000 geni diversi.

La regolazione endocrina abbiamo detto che LH induce all’inizio nella fase fetale la proliferazione delle cellule di Leidigh e una volta differenziati iniziano a produrre testosterone e l’LH serve quindi poi per la sintesi di testosterone.