Malattie infettive

Ruolo dei microrganismi in natura e loro utilizzazione da parte dell'uomo

• Concorrono all'equilibrio biologico sulla Terra (cicli geochimici e azione fertilizzante del suolo).
• Sono responsabili delle malattie infettive nell'uomo, negli animali e nelle piante.
• Vengono chiamati in causa nell'insorgenza di eventi neoplastici (forme tumorali).
• Sono impiegati come modelli sperimentali per lo studio della genetica molecolare e della fisiologia cellulare.
• Causano degradazione degli alimenti.
• Utilizzati come biomassa.
• Vengono sfruttati per la produzione di sostanze utili all'uomo (sieri e vaccini, antibiotici, vitamine ed altre sostanze/molecole utili).

La cellula

I primi e più elementari organismi che hanno abitato il nostro pianeta sono stati i batteri. Il loro DNA è generalmente disperso nel citoplasma in una regione interna della cellula chiamata nucleoide.

La forma dei batteri

Sulla base della loro morfologia i microrganismi possono essere suddivisi in quattro tipologie principali (forma riportabile, fondamentalmente, a due figure geometriche: il cilindro e la sfera).

• Cocchi (cellule di forma sferica)
• Bacilli (forma bastoncellare)
• Curvilinei o spiraliformi
• Quadrati

Cocchi

A seconda della specie batterica presentano fogge ed assetti differenziati in funzione del piano in base al quale ha luogo la divisione cellulare.

• Formazione di coppie di cellule: Un solo piano diplococchi
• Assemblaggio in catene di cellule: streptococchi
• Formazione di tetradi: Due piani produce un agglomerato di cubetti
• Tre piani raggruppati a otto cellule: sarcine, oppure assemblamenti di diverse cellule stafilococchi

Bacilli

Presentano notevoli variazioni morfologiche e di assetto spaziale a seconda del genere differendo per dimensioni ed aspetto dei singoli elementi strutturali.

• Lunghezza e diametro simili: Coccobacilli (es. Escherichia coli)
• Bacilli fusiformi: estremità assottigliate
• Divisione cellulare lungo asse dando luogo a due possibili disposizioni: minore diplobacillo e streptobacillo

In alcuni casi i movimenti post-fissione portano le varie cellule batteriche a disporsi l'una accanto all'altra con tipica disposizione a palizzata. Oppure si dispongono ad angolo acuto nel loro punto di divisione assumendo la tipica forma a "V".

Spiraliformi

Si tratta di microrganismi a forma bastoncellare che mostrano un classico assetto incurvato o a virgola. Spesso si presentano disposti a catena assumendo una foggia a spirale come si verifica nel caso del genere Vibrio. Elementi bastoncellari caratterizzati da una o più curvature lungo l'asse longitudinale vengono inquadrati come: spirilli. Spirochete sono di forma cilindrica con numerose curvature rigide o flessibili, dotate di una spiccata motilità (movimento caratteristico "a cavatappi").

La capacità posseduta da uno stesso microrganismo di acquisire differenti assetti morfologici viene definita: pleomorfismo. Fattori ambientali influenzano dimensioni (modificazioni della biosintesi e dello sviluppo della parete) e tal volta la forma dei batteri. Batteri privi di parete cellulare che assumono aspetto filamentoso in condizioni ottimali di crescita e aspetto tipico a ciambella in terreni minimi (poveri in nutrienti).

Cellula batterica

Strutture fondamentali

• Membrana citoplasmatica
• Parete

Strutture accessorie

• Pili
• Flagelli
• Capsula

Nucleoide

È costituito da un'unica molecola di DNA a struttura bicatenaria. Mancano i nucleoli. Mancano la membrana nucleare, un apparato mitotico e gli istoni. Il DNA è associato in un punto con un'invaginazione della membrana citoplasmatica denominato mesosoma (ruolo nella separazione dei due cromosomi gemelli). È rappresentato da una doppia elica di catene polinucleotidiche. Governa la trasmissione dei caratteri da una cellula alle generazioni successive. Presiede alla sintesi dei fattori che regolano il metabolismo cellulare.

Plasmidi

La maggioranza dei batteri può possedere materiale genetico extracromosomiale sotto forma di filamenti di DNA superavvolto a doppia elica ed a struttura circolare: i plasmidi. Sono dotati di autonomia replicativa e veicolano informazioni genetiche non essenziali per la sopravvivenza del batterio (come avviene per i geni essenziali o housekeeping) ma gli consentono di acquisire caratteri di virulenza. Possono contenere 50-100 geni. Alcuni plasmidi possono integrarsi nel cromosoma batterico divenendo episomi (la loro replicazione ha luogo in sincronia con quella del cromosoma).

Citoplasma

È estremamente semplice, povero di dettagli morfologici, costituito da una matrice fluida. Mostra un aspetto granulare e inclusioni non solubili alcuni dei quali fondamentali/essenziali e presenti in ciascuna cellula batterica.

Ribosomi

RNA (60%); tre diverse molecole proteine (40%); 55 differenti molecole proteiche presentano una costante di sedimentazione di 70S (Svedberg).

• Subunità leggera 30S: RNA 16S, 21 proteine
• Subunità pesante 50S: RNA 5S, 23S, 43 proteine

Granulazioni

• Glicogeno: in determinate condizioni ambientali i batteri non utilizzano tutto il glucosio, ma ne stoccano una parte sotto forma di glicogeno (formando delle vere e proprie inclusioni).
• Polifosfato: alcuni batteri accumulano fosfato inorganico convertito in polifosfato (formando granuli metacromatici o volutina). Funzione di riserva per la sintesi degli acidi nucleici (elemento peculiare per l'identificazione dei corinebatteri).
• Poli-beta-idrossibutirrato (PHB): riserve cellulari di carbonio ed energia (componenti di natura lipidica riscontrati nelle cellule in fase di sporulazione).
• Zolfo: alcuni microrganismi contengono al loro interno granuli di zolfo inorganico (solfuri) in forma di inclusioni organuli avvolti da una membrana proteica (riserva energetica).
• Vacuoli gassosi: formazioni tubolari vuote costituite da vescicole proteiche (batteri acquatici: ne consentono il galleggiamento).
• Magnetosomi: costituiti da membrane di natura proteica ripiene di un composto ferroso (presenti nei microrganismi microaerofili e anaerobi obbligati).
• Clorosomi: presenti nei batteri fotosintetici.

Membrana citoplasmatica dei batteri

Funzione della membrana citoplasmatica nei procarioti:

• Regola il flusso dei nutrienti
• È sede di processi biosintetici
• Produzione di energia
• Sito di ancoraggio per strutture accessorie
• Funzione di secrezione
• Funzione di regolazione

Attraverso il mesosoma svolge una funzione di guida nella divisione cellulare, nella sintesi dei lipidi e nel trasporto degli esoenzimi. Nei batteri fotosintetici svolge, la funzione clorofilliana.

Composizione chimica

Dal punto di vista chimico ricalca l'organizzazione della membrana cellulare eucariotica. È costituita da lipidi (40%), proteine (60%) e ridotte quantità di carboidrati. Presenta uno spessore di circa 8 nm ed appare costituita da un tipico doppio strato fosfolipidico (non contiene steroli ad eccezione dei micoplasmi). La componente lipidica presenta caratteristiche fisico-chimiche differenti rispetto a quella eucariotica che consentono al batterio di colonizzare ambienti ostili. In molti batteri contiene molecole pentacicliche (simili agli steroli) chiamate opanoidi (presenti in quantità rilevanti nel nostro ecosistema).

La struttura generale delle membrane biologiche corrisponde ad un doppio strato fosfolipidico. Dal momento che i fosfolipidi, in soluzione acquosa, si aggregano, essi tendono a formare in modo del tutto spontaneo strutture a doppio strato, con gli acidi grassi rivolti verso l'interno (a costituire un ambiente idrofobico) e le porzioni idrofiliche esposte verso il mezzo esterno acquoso. Attualmente il modello più accreditato è il cosiddetto modello a mosaico fluido (Singer e Nicholson) che distingue due tipi di proteine di membrana: le proteine periferiche e quelle integrali.

• Le proteine periferiche risultano unite alla membrana attraverso legami deboli (per cui possono con notevole facilità essere rimosse); sono solubili in soluzioni acquose e costituiscono all'incirca il 20-30% del totale delle proteine di membrana.
• Le proteine integrali, il 70-80%, devono la loro definizione perché si possono estrarre con difficoltà dalla membrana ed in questo caso, una volta liberate dai lipidi si dimostrano insolubili in soluzione acquosa.

Si evince che la membrana citoplasmatica concorre a definire un sistema altamente organizzato ed asimmetrico, al tempo stesso, flessibile e dinamico.

Membrana (trasporto)

I meccanismi che operano selettivamente il transito molecolare sono riconducibili a due sistemi di trasporto.

Passivo

Consente il passaggio di soluti attraverso la membrana in funzione della concentrazione: direzione verso il compartimento a concentrazione più bassa (i soluti si muovono dai distretti ad alta concentrazione a quelli a bassa concentrazione). Senza alcun dispendio energetico. Fattori limitanti: peso molecolare, forma, carica, solubilità del soluto.

Attivo

Il movimento di soluti contro gradiente di concentrazione richiede un consumo di energia e può essere di due tipi:

• Semplice: Prevede l'intervento di una singola proteina (carrier) della membrana plasmatica.
• Complesso: Richiede l'intervento di tre o più proteine una delle quali è una ligandinaperiplasmatica che interagisce con una proteina integrale di membrana favorendo l'apertura di un canale transmembranario che consente il passaggio del soluto nel citoplasma (aminoacidi ramificati, galattosio, arabinosio, maltosio, ribosio).

Meccanismo chemiostatico-guidato: Si basa su un gradiente ionico stabilito precedentemente dalla pompa protonica o da quella del sodio. Ne esistono tre tipi:

• Uniporter
• Symporter
• Antiporter

Genetica batterica

La genetica definisce ed analizza il concetto di ereditarietà... ovvero di costanza o variazione nell'ambito del vasto campo delle funzioni fisiologiche che caratterizzano gli organismi. L'unità dell'ereditarietà è il gene, segmento di DNA che trasporta nella sequenza nucleotidica l'informazione per un determinato particolare carattere fisiologico o biochimico. L'informazione genetica è conservata in una sequenza di basi nell'acido desossiribonucleico (DNA) o nell'acido ribonucleico (batteriofagi e virus ad RNA). In gran parte le molecole di DNA sono a doppio filamento con basi complementari (A-T; G-C) appaiate da legami idrogeno al centro della molecola. La complementarietà delle basi mette in grado un filamento (filamento stampo) di fornire l'informazione per la copia o l'espressione dell'informazione in un altro filamento (filamento codificante).

Le informazioni genetiche dei batteri risiedono sia a livello di cromosoma che in elementi extracromosomici (plasmidi e trasposoni). I geni essenziali per la crescita batterica sono trasportati dal cromosoma mentre i plasmidi veicolano geni associati a funzioni specializzate ed accessorie. I geni strutturali vengono trascritti in RNAm per la sintesi delle proteine. I geni non strutturali codificano gli RNAt e gli RNAr.

Cromosoma batterico

Il cromosoma batterico (5000 geni) è una molecola di DNA circolare a doppio filamento le cui dimensioni variano da specie a specie. Ad esempio: 0.58 x 10⁶ paia di basi in Mycoplasma genitalium (minimo) e 4.639 x 10⁶ paia di basi per Escherichia coli. Non risulta rivestito da alcuna membrana nucleare ed è aploide (presenta una singola copia per cellula). La trasmissione delle informazioni genetiche della cellula parentale alle cellule figlie ha luogo secondo una replicazione semiconservativa utilizzando entrambi i filamenti come stampo in modo da garantire la copia esatta del genoma d'origine.

Nel cromosoma batterico risiede una sequenza specifica denominata OriC che rappresenta il punto di partenza del processo di duplicazione dell'intera molecola. Il processo prevede in sequenza: apertura della doppia elica del DNA parentale ad opera di elicasi (srotolano la doppia elica in entrambe le direzioni) generando due forcelle di replicazione. In loro corrispondenza opera l'enzima primasi che polimerizza corte molecole di RNA "primer" che fungono da innesco per l'azione della DNA polimerasi. Quest'ultimo è in grado di sintetizzare filamenti di DNA unicamente nella direzione che va dal carbonio 5' al carbonio 3'. I primer di RNA vengono poi progressivamente degradati dalla DNA polimerasi (che possiede anche un'attività esonucleasica in direzione 5'-3') e sostituiti con molecole di DNA neosintetizzate i singoli frammenti nucleotidici vengono quindi uniti grazie all'intervento di una specifica DNA ligasi.

Nel corso del processo che, in fase di srotolamento, determina forti sollecitazioni sui filamenti parentali, intervengono degli enzimi denominati topoisomerasi (fondamentali per la moltiplicazione batterica) che agiscono neutralizzando questi effetti. Questi enzimi sono il bersaglio/target degli antibiotici chinolonici.

Una molecola singola di DNA circolare può contenere da 580 a circa 4600 kbp (kilo - base pair, migliaia di paia basi). Un virus piccolo può contenere 5 kbp di DNA mentre una sola molecola di DNA che forma il cromosoma di Escherichia coli è pari circa a 4639 kbp. Ogni paio di basi è separato dal vicino di circa 0.34 nm per cui la lunghezza totale del cromosoma è di circa 1 mm. Essendo le dimensioni totali della cellula batterica 1000 volte più piccole, è necessaria una notevole quantità di pieghettature: superavvolgimento.

I cerchi di DNA, cromosoma e plasmidi, che contengono le informazioni genetiche necessarie per la loro stessa replicazione vengono definiti repliconi. La replicazione del DNA batterico prende inizio a livello del locus ORI, regione del DNA associata alla membrana cellulare. Nell'Escherichia coli la replicazione termina in una regione chiamata TER.

Mutazioni

Nonostante la fedeltà e l'accuratezza di sintesi operata dalla DNA polimerasi, può verificarsi che, in fase di duplicazione, una base azotata si trovi in una particolare forma elettrochimica che la rende strutturalmente simile ad una base differente, per cui si verificano errori di incorporazione e di accoppiamento che originano una popolazione batterica con un genotipo mutato rispetto a quello parentale. Un evento simile può conseguire anche all'inserimento, in determinati punti del genoma, delle cosiddette sequenze di inserzione (IS). IS: corte sequenze nucleotidiche 1500-2000 paia di basi con all'estremità una sequenza ripetuta ed invertita di 20-40 paia di basi che possono spostarsi da un punto all'altro del genoma. Nei batteri le mutazioni sono a carico dei singoli nucleotidi (mutazioni puntiformi) e si verificano secondo 4 differenti meccanismi:

• Inversione: nel corso della duplicazione del DNA si registra l'inserimento di due basi successive
• Inserzione: nella fase di duplicazione del DNA si aggiungono una o più basi
• Delezione: nel corso della duplicazione del DNA viene persa una base azotata
• Sostituzione: in fase di duplicazione del DNA una base azotata viene sostituita da un'altra

Le mutazioni per delezione e per inserzione causano uno "scivolamento" della lettura del gene (frameshift) e nella maggior parte dei casi codificano per proteine inattive.

La ricombinazione

La ricombinazione è lo scambio di regioni omologhe di DNA che porta a nuove combinazioni geniche. Nei procarioti si verifica attraverso meccanismi di trasferimento che creano diploidi parziali. Nei batteri vengono identificati tre meccanismi principali di trasferimento genico:

• Coniugazione
• Trasduzione
• Trasformazione

Nei procarioti la ricombinazione è un processo unidirezionale ossia un frammento di materiale genetico (esogenote) è donato ad una cellula ricevente (endogenote) e può andarsi ad integrare nel cromosoma:

• Passaggio di un frammento di DNA nudo (trasformazione)
• Trasferimento diretto tra due microrganismi in temporaneo contatto (coniugazione)
• Trasporto di DNA batterico ad opera di batteriofagi (trasduzione)

Trasformazione interspecifica e intraspecifica

La trasformazione può avvenire tra specie molto vicine. Trasformazione interspecifica e trasformazione intraspecifica:

• Legame di una molecola di DNA a doppia elica mediante una proteina di membrana.
• Passaggio di uno dei due filamenti all'interno della cellula mentre l'attività nucleasica degrada l'altro filamento.
• Il filamento singolo viene legato da proteine specifiche nella cellula ed ha luogo la ricombinazione con regioni omologhe del cromosoma batterico, mediata dalla proteina RecA.
• La cellula è trasformata (geneticamente modificata rispetto alla cellula parentale).

Competenza

Si tratta di un particolare stato fisiologico nel corso del quale la cellula ricevente mostra una spiccata capacità di incorporare molecole di DNA esogeno. Lo stato di competenza si manifesta in una coltura batterica al termine della fase esponenziale di crescita ed è riportabile alla produzione di particolari proteine (fattori di competenza) che favoriscono la penetrazione del DNA. Questo stato può essere indotto artificialmente attraverso l'esposizione delle cellule al cloruro di calcio (rende l'involucro maggiormente permeabile) seguita da shock termico di breve durata (bassa efficienza di trasformazione) oppure da brevi impulsi elettrici (alta efficienza di trasformazione).