Lezioni, Fisiologia umana

Liberazione di neurotrasmettitori (NT)

I NT vengono riforniti da:

• Trasportatori di membrana
• Biosintesi locale
• Trasporto assonale.

Il NT viene accumulato nelle VS per mezzo di sistemi di trasporto che sfruttano il gradiente vescicolare di H+ generato da una pompa ATP-dipendente. Le VS con il NT vengono trasportate in zona di liberazione, dove si ancorano ai siti di liberazione.

La depolarizzazione della membrana, scatenata dall’arrivo di un PdA, causa l’ingresso di ioni Ca++ che scatena il processo di fusione e causa la liberazione del NT e la fusione della membrana vescicolare con la membrana citoplasmatica.

Le VS rivestite di clatrina vengono trasportate fino al reticolo endoplasmatico liscio, dove rientrano a far parte del pool vescicolare di riserva (RP). Un ciclo più rapido potrebbe essere quello del kiss and run, che le riporta rapidamente nel pool di liberazione (RRP). Il NT diffonde nello spazio sinaptico e la sua interazione con i recettori postsinaptici scatena la genesi dell’EPSP.

Sinapsi chimiche e vescicole sinaptiche

Nelle sinapsi chimiche l’elemento presinaptico opera la trasduzione elettro-chimica e secerne il neurotrasmettitore. Quello postsinaptico capta e trasduce il messaggio chimico in una risposta elettrica e\o metabolica.

A livello presinaptico ci sono piccoli organelli, le vescicole sinaptiche, deputate all’immagazzinamento e liberazione di NT. Le vescicole presinaptiche si muovono lungo una rete citoscheletrica, fatta principalmente da filamenti di actina, che fa contatto con la membrana presinaptica in corrispondenza delle zone attive, dove le vescicole possono ancorarsi specificamente. Nelle zone attive sono concentrate proteine specifiche: proteine di ancoraggio per la vescicola, altre che regolano dinamicamente l’interazione tra vescicola e membrana e canali del Ca++v: questi trasducono il segnale elettrico in un influsso localizzato di ioni Ca++ che determina fusione della vescicola con la membrana ed esocitosi del NT.

Nella cellula postsinaptica, di fronte alle zone attive, ci sono ispessimenti detti densità postsinaptiche, che contengono i recettori per i NT e trasduttori del segnale come proteine G eteromeriche, enzimi e canali ionici. Il legame del NT con il recettore determina eventi elettrici nel caso di recettori canale o reazioni metaboliche più o meno complesse nel caso di recettori accoppiati a proteine G.

La densità postsinaptica presenta una complessa organizzazione biomolecolare che consente di regolare diversi processi importanti nella trasduzione dei segnali sinaptici:

• La disposizione dei diversi recettori rispetto ai siti di liberazione
• L’interazione dei recettori con diverse proteine regolatrici (chinasi, fosfatasi, NOS)
• L’interazione del sistema postsinaptico con il citoscheletro di actina
• La regolazione del trafficking e turnover recettoriale
• L’induzione ed espressione della plasticità sinaptica

La cellula nervosa utilizza come NT piccole molecole o amminoacidi o amine che possono essere sintetizzati in loco da enzimi citoplasmatici presenti a livello dei terminali e ricaptate dallo spazio sinaptico; il NT viene immagazzinato nelle vescicole e può essere più volte riutilizzato mediante un economico ciclo eso-endocitico.

La liberazione di NT avviene attraverso la fusione esocitica di una vescicola sinaptica:

• Le vescicole ricircolano attivamente durante l’attività sinaptica
• Il contenuto di una vescicola è coerente con l’ampiezza di un potenziale di placca in miniatura
• Il numero di vescicole perdute e il numero di quanti liberati sono in accordo
• Con la tecnica del quick-freezing o freeze fracturing (congelamento della placca motrice e frattura) si osservano molte immagini di fusione di vescicole con la membrana presinaptica.

Neurotrasmettitori e neuropeptidi

Entrambi i tipi di neurotrasmettitore sono immagazzinati in vescicole da cui vengono liberati nello spazio extracellulare in seguito a un aumento della concentrazione citosolica di Ca++. I NT classici (GABA, Gly, Glu, Ach e amine biogene) sono immagazzinati in vescicole sinaptiche piccole (40-50 nm) che sono accumulate in grande numero nei terminali nervosi, particolarmente addensate nelle zone attive.

I neuropeptidi si trovano invece in vescicole secretorie di maggiori ed eterogenee dimensioni (100-300 nm di diametro).

Le VS contenenti neuropeptidi, raramente in prossimità della membrana, potrebbero essere quelle che vengono liberate con maggiore difficoltà (impulsi elettrici a più alta frequenza), dato che le modalità di sintesi e riempimento, nelle VS, dei neuropeptidi sono temporalmente molto più lunghe rispetto ai rapidi meccanismi dei NT a basso peso molecolare.

Il ruolo funzionale della coliberazione di più NT, anche se ancora non del tutto chiarito, è presumibilmente implicato:

• Nei processi di plasticità sinaptica attività-dipendente
• Nella neuromodulazione pre- (autorecettori) e post-sinaptici

Meccanismi molecolari del rilascio dei NT

Proteine implicate nel ciclo delle vescicole sinaptiche

• Proteine che interagiscono col citoscheletro: sinapsine
• Deputate all’accumulo di NT all’interno della vescicola: pompa protonica e trasportatori vescicolari
• Che mediano l’ancoraggio delle vescicole alle zone attive: Rab3, sinaptogamina
• Sensore per il Ca++: sinaptogamine e rabfillina
• Di fusione: v-SNARE, sinaptobrevina
• Componenti del poro di fusione: sinaptofisine
• Integrali coinvolte nella biogenesi delle vescicole e nel sequestro delle proteine di fusione (sinaptofisine, SV2)
• Proteine G monomeriche che assicurano la corretta direzionalità del ciclo eso-endocitotico (Rab3)
• Proteinchinasi
• Marker della membrana vescicolare: sinaptogamina, sinaptofisina (permettono la ricaptazione selettiva di membrana corrispondente alla vescicola sinaptica).

L’esocitosi delle vescicole sinaptiche, scatenata dall’invasione del terminale da parte del PdA e dal conseguente influsso di ioni Ca++ attraverso il canale voltaggio-dipendente, è un evento estremamente rapido.

Nonostante sia un evento rapido, è molto preciso: non si genera infatti continuità tra citoplasma e spazio extracellulare e con recupero preciso e selettivo della membrana vescicolare.

Il terminale nervoso è relativamente indipendente dal corpo, è dotato di un’adeguata riserva di vescicole sinaptiche e NT ed è in grado di rigenerarla mediante sintesi in loco di NT e recupero delle vescicole già utilizzate.

I terminali nervosi esprimono una notevole quantità di proteine di trasporto specifiche per il NT da esse liberato. Ci sono:

• Trasportatori Na+ dipendenti, con 6-10 segmenti transmembrana, incaricati del trasporto del Glu
• Trasportatori Na\Cl dipendenti per altri NT. Hanno 12 segmenti transmembrana e accoppiano il ciclo di trasporto all’ingresso di Na+ secondo il suo gradiente elettrochimico. I principali trasmettitori di questo tipo sono DAT, NET, SERT, GAT, rispettivamente trasportatori di DA, N, 5HT e GABA.

Questi trasportatori si trovano anche sulle cellule gliali. Questo contribuisce alla rapida ed efficiente rimozione del NT dallo spazio sinaptico, per porre fine al segnale ed evitare desensitizzazione del recettore.

Una volta nel citoplasma il NT va concentrato attivamente nelle vescicole sinaptiche: le vescicole immagazzinano un numero costante e riproducibile (10³-10⁴ molecole). Il riempimento è un processo attivo in cui il NT viene internalizzato contro gradiente di concentrazione. L’energia per il trasporto deriva dallo scambio con ioni H+ che sono molto più concentrati all’interno della vescicola e sono spinti verso il citoplasma anche da una notevole ddp.

Vista l’enorme rapidità della trasmissione sinaptica, solo le vescicole già ancorate alla membrana presinaptica sono coinvolte nella fase più precoce della liberazione di NT: queste formano un pool disponibile (0,5-15%) all’esocitosi, molto importante funzionalmente ma di dimensioni ristrette.

La maggior parte delle vescicole non è in diretto contatto con la membrana presinaptica ed è tenuta in sede da interazioni con la matrice citoscheletrica, formata principalmente da actina e spectrina: questo è il pool di riserva (85-95%) da cui vengono reclutate vescicole per occupare nuovamente siti di ancoraggio alla membrana presinaptica, resi disponibili dopo l’esocitosi delle vescicole del pool disponibile.

Il Ca ha il DUPLICE ruolo: 1) di determinare la fusione esocitotica delle VS del pool di liberazione e 2) di promuovere il reclutamento dal pool di riserva.

Le sinapsine, secondo il loro stato di fosforilazione Ca-dipendente, hanno il ruolo di regolare il traffico delle VS tra i due pool, in quanto la loro fosforilazione determina il distacco sia dalle VS che dall’actina. La disponibilità delle VS dipende quindi dal grado di fosforilazione delle sinapsine, a sua volta legato ai livelli di Ca intraterminali, e questo processo può contribuire a variare l’efficienza della successiva attivazione sinaptica nel produrre liberazione del NT.

Fasi del processo di esocitosi

1. Liberazione delle vescicole dal citoscheletro: l’interazione con il citoscheletro è mediata dalle sinapsine che interagiscono con l’actina e ne favoriscono la polimerizzazione. La fosforilazione delle sinapsine produce la sua dissociazione sia dalla vescicola sia dall’actina. La disponibilità delle vescicole per l’esocitosi dipende dallo stato di fosforilazione delle sinapsine, a propria volta regolato dei livelli intracellulari di Ca++. Le sinapsine possono venir fosforilate per azione di varie chinasi sia Ca\calmodulina dipendente che cAMP dipendente (PKA).
2. Traffico: l’indirizzamento verso le zone attive si serve di una proteina G specifica per la membrana delle vescicole (Rab3). Questa proteina si associa reversibilmente alla membrana delle vescicole quando è legata a GTP e in questo stato interagisce con la proteina Rim situata in corrispondenza delle zone attive. Una volta che la VS va incontro al priming (emifusione), il GTP viene idrolizzato a GDP e Rab3 si stacca dalla VS.
3. Ancoraggio (docking) alle zone attive: avviene ad opera di un complesso macromolecolare a cui partecipano proteine delle vescicole e proteine della membrana presinaptica. L’ancoraggio è assicurato da una serie di interazioni, ad esempio, tra: a) sinaptotagmina (v), neurexina I (m), Snap-25 (m) e complesso sintaxina/can Ca-voltaggio-dipendente o b) Rab3 (v) e Rim (m). Alcune di queste interazioni posizionano le VS molto vicino ai canali del Ca, esponendole, quindi, ad alte concentrazioni di Ca alla loro apertura.
4. Attivazione (priming), cioè predisposizione alla fusione (emifusione). In seguito all’ancoraggio delle vescicole alla membrana presinaptica, le proteine SNARE della vescicola (sinaptobrevina e sintaxina) e della membrana presinaptica (Snap-25) iniziano ad assemblarsi strettamente fino a portare le 2 membrane in strettissimo contatto (zippering = chiusura lampo). Aiutano il processo le proteine Munc 18 e 13 e Rim. Lo stato di emifusione, in condizioni basali, non arriverebbe allo stato di fusione per la presenza di complexine, che si legano al complesso SNARE.
5. Fusione e rilascio del NT: sia spontanea (MEPP o minis) o scatenata dall’ingresso di Ca. Quando il Ca entra, in seguito al PdA, si lega con la sinaptotagmina, ne induce una variazione conformazionale attivandone il legame ai fosfolipidi di membrana. Si ha il passaggio da emifusione a fusione vera e propria con uscita rapida del NT. Prima dell’endocitosi l’ATPasi NSF e le proteine SNAP determinano lo smantellamento del complesso SNARE. Questo segue necessariamente la fusione perché NSF e SNAP riconoscono il complesso SNARE solo in forma di complesso su un’unica membrana (fusione).
   SNARE = recettori per le SNAP
   NSF = fattore sensibile alla N-etilmaleimide
   SNAP = proteine solubili di attacco per il NSF
6. Recupero della membrana della vescicola dall’assolemma (riciclaggio endocitico delle VS) e ricostituzione della vescicola. Le VS sinaptiche che hanno liberato il proprio contenuto vengono riciclate e riutilizzate ripetutamente: nella giunzione n-m un PdA induce il rilascio del 10% delle VS; ad una frequenza fisiologica di 10Hz, il terminale verrebbe depleto in pochi min, con blocco della trasmissione. È un processo molto efficiente e veloce. L’endocitosi delle VS può utilizzare 2 meccanismi:
   • Kiss and run, nel caso in cui le VS non siano collassate completamente nella membrana presinaptica ma abbiano liberato il loro contenuto tramite un poro di fusione: le VS vengono recuperate mediante la chiusura del poro di fusione e la dissociazione della 2 membrane
   • Nel caso in cui le VS siano collassate nella membrana, c’è bisogno dell’intervento di proteine accessorie come le adattine che separino e raccolgano i componenti specifici della membrana vescicolare e favoriscano la formazione di rivestimento di clatrina per la curvatura della membrana.
   Entrambi i meccanismi richiedono un processo di separazione delle due membrane (fissione) ad opera della dinamina, che polimerizza a formare un anello intorno al collo della VS, e antifisina.
   Le VS ricostituite possono rimanere nel pool disponibile, venendo nuovamente indirizzate e ancorate alla membrana presinaptica, oppure possono essere sequestrate dal citoscheletro e tornano così a far parte del pool di riserva.

La macchina di fusione è basata sulla presenza di un fattore ad attività ATPasica chiamato NSF, che viene riconosciuto da proteine solubili, SNAP, a loro volta capaci di legare proteine di membrana, dette SNARE (recettori per le SNAP). Le SNARE sono specifiche per ogni membrana e capaci di riconoscersi a coppie: una proteina della membrana vescicolare (v-SNARE: sinaptobrevina) e la corrispondente proteina sulla membrana bersaglio (t-SNARE: sintaxina e Snap-25). Le SNARE possiedono vari domini con struttura ad elica con grande potenzialità a formare con le SNARE omologhe strutture super avvolte α energeticamente favorite e molto stabili. Le SNARE vescicolari e presinaptiche interagiscono iniziando dall’estremità NH2 terminale via via fino alla porzione COOH-terminale, avvicinando così le 2 membrane fino a raggiungere uno stato di emifusione metastabile, che tende a procedere verso la fusione completa (modello a chiusura lampo o zippering). In questo quadro altre proteine coinvolte possono inibire o facilitare il passo cruciale della fusione, semplicemente modificando la propria conformazione in risposta a un segnale appropriato, come il legame del Ca++. Ad esempio sinaptogamina: una proteina integrale delle VS che è in grado di interagire con i fosfolipidi della membrana presinaptica in maniera Ca++ dipendente. Il complesso SNARE-sinaptogamina è localizzato in prossimità dei canali del Ca++, per cui all’arrivo del PdA, un imponente flusso di Ca++ investe il complesso di fusione, determinando un istantaneo cambiamento conformazionale nella sinaptogamina e il procedere esplosivo della fusione.

Dopo la fusione, il complesso delle SNARE viene a trovarsi associato a un’unica membrana (complesso cis). È necessario che le SNARE dei complessi cis vengano separate in monomeri, una reazione che richiede energia, prima della fissione endocitica per poi essere incorporati nelle rispettive membrane di competenza (SNARE in posizione trans).

L’attività ATPasica del NSF, che si associa mediante le SNAP ai complessi cis di fusione, ha il ruolo di fornire l’energia necessaria per permettere il distacco delle SNARE complementari rigenerando la loro forma nativa (ATP è necessaria per ridurre l’affinità reciproca delle 2 proteine complementari fino a permetterne il distacco).

Dopo il disassemblaggio del processo di fusione intervengono proteine di sequestro, che interagendo reversibilmente con le SNARE monomeriche, contribuiscono a ricaptare e stabilizzare queste proteine (es. Munc 18).

Destino del NT liberato

Il NT, oltre che a combinarsi con il recettore postsinaptico, può subire altri destini, che mirano sia ad abbassarne la concentrazione, promuovendone la dissociazione dai recettori e la cessazione dell’azione postsinaptica, sia a economizzare NT, diminuendo il consumo energetico per la biosintesi:

• Ricaptazione del NT all’interno della terminazione nervosa per essere riutilizzato in successivi cicli secretori
• Ricaptazione da parte delle cellule gliali
• Inattivazione nello spazio sinaptico
• Diffusione extra-sinaptica

Sindrome miasteniforme di Lambert-Eaton (LEMS)

La sindrome miasteniforme di Lambert-Eaton (LEMS) è una rara patologia paraneoplastica, una canalopatia autoimmune, ossia una malattia neuromuscolare con ipostenia prevalentemente prossimale.

• La causa è da ricercarsi in una ridotta liberazione di Ach a livello della placca neuromuscolare, dovuta all'effetto di autoanticorpi diretti contro i canali del Ca presinaptici. La debolezza muscolare è, quindi, causata da un’alterazione della trasmissione dell’impulso a livello della giunzione neuromuscolare.
• Recenti risultati suggeriscono che i principali fattori patogenetici siano anticorpi contro i canali del Ca tipo P/Q, ad alta soglia, presinaptici neuronali, che costituiscono una componente essenziale nel meccanismo di rilascio del neurotrasmettitore.
• La sinaptotagmina, una delle proteine sinaptiche associate funzionalmente al canale del calcio voltaggio-dipendente, è risultata essere immunogena nella patogenesi della malattia.
• Al contrario di quanto accade nella Myasthenia Gravis, l’attivazione ripetitiva non determina affaticamento, ma anzi può produrre il movimento desiderato, grazie al graduale potenziamento del rilascio di trasmettitore.

Caratteristiche della liberazione dei NT classici

La liberazione dei NT classici ha caratteristiche uniche:

L’esocitosi delle VS, scatenata dall’entrata di Ca, per l’invasione della terminazione da parte del PdA, è un evento molto rapido (poche centinaia di msec).

Nonostante la rapidità è un processo di alta efficienza e precisione, con r