Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

Laboratorio di preparazione estrattiva e sintesi dei farmaci

3° Anno - a.a. 2020-2021

Prof. Annalida Bedini

Sicurezza in laboratorio

Le attività che si svolgono nei laboratori chimici comportano una serie di rischi che possono essere sia di tipo infortunistico, legato ai rischi di lesioni traumatiche, sia di tipo igienico-ambientale, legati all’esposizione ad agenti e/o fattori nocivi presenti nell’ambiente di lavoro.

Rischio e sicurezza

Il rischio può essere definito come la probabilità di avere un danno per esposizione a un pericolo. La sicurezza consiste nella riduzione al minimo realizzabile del rischio.

Rischi di tipo infortunistico

• Esempi: lesioni per ferite da taglio, lesioni da ustioni termiche.

Rischi di tipo igienico-ambientale

• Esempi: agenti di tipo fisico (esposizione prolungata a rumore, ultrasuoni, radiazioni ionizzanti), agenti di tipo chimico (inalazione, contatto, ingestione di sostanze).

Valutazione della pericolosità di un composto

Per agenti di tipo chimico si effettua attraverso pittogrammi, indicazioni di pericolo e consigli di prudenza, scheda di sicurezza (MSDS: Material Safety Data Sheet; fornita dalla ditta).

La singola persona è responsabile nel condurre un esperimento in maniera sicura senza essere pericolosa per sé stessa e per gli altri, quindi è tenuta a conoscere ed osservare le regole di sicurezza di base essenziali di un laboratorio di chimica organica. Prima di cominciare qualsiasi esperimento viene valutata la pericolosità dei reagenti che ci si appresta ad utilizzare.

GHS: Globally Harmonized System

Entrato in vigore nel 2009, il GHS è il Sistema mondiale armonizzato di classificazione e di etichettatura delle sostanze chimiche che ha l’obiettivo di stabilire una base comune e coerente per il pericolo chimico per:

• Facilitare il crescente commercio internazionale;
• Proteggere la salute umana e l’ambiente;
• Uniformare le regolamentazioni diverse fra i vari paesi;
• Condividere uno standard internazionale di sicurezza.

Quasi tutti i paesi del mondo lo hanno adottato. Ci sono quindi degli standard mondiali di sicurezza.

Pittogrammi

Simboli presenti nell’etichetta del prodotto che danno informazioni sommarie sulla pericolosità alla quale si va incontro maneggiando quella determinata sostanza. Vecchi: prima del sistema GHS. Capita di incontrarli comunque, se si hanno nel deposito sostanze vecchie.

Indicazioni di pericolo e prudenza

Ad ogni sostanza è associata un’indicazione di pericolo e delle indicazioni di prudenza, date da una lettera (P: prudenza, H: pericolo) seguita da un codice a 3 cifre. Vecchia classificazione: R: Rischio; S: Sicurezza. Frasi supplementari per criteri solo UE e non GHS: EU + tre cifre (o + il numero della vecchia frase R). Queste informazioni sono riportate nell’etichetta.

Esempio: Dai pittogrammi capiamo che è una sostanza infiammabile e corrosiva. Queste informazioni è bene averle prima di ricevere il prodotto, perché alcuni laboratori potrebbero non essere idonei alla conservazione o al maneggiamento di determinate sostanze pericolose. Le ditte forniscono già da subito una scheda di sicurezza della sostanza. Esempio di ditta: Sigma-Aldrich.

Ha in catalogo circa 300 mila sostanze. La scheda di sicurezza fornisce informazioni esaustive di una sostanza o miscela per l’uso in luoghi di lavoro in 16 punti obbligatori:

• Identificazione della sostanza e della società produttrice
• Indicazione dei pericoli
• Composizione ed informazione ingredienti
• Misure primo soccorso
• Misure antincendio
• Provvedimenti in caso di fuoriuscita accidentale
• Manipolazione e stoccaggio
• Controllo dell’esposizione e protezione individuale
• Proprietà chimico-fisiche
• Stabilità e reattività
• Informazioni tossicologiche
• Informazioni ecologiche
• Considerazioni sullo smaltimento
• Informazioni sul trasporto
• Informazioni sulla regolamentazione
• Altre informazioni

Punto di infiammabilità

Il flash point di comuni solventi è la temperatura più bassa alla quale si formano vapori in una quantità tale da determinare il fenomeno della combustione in presenza di ossigeno e di un innesco. Non è il punto di ebollizione! Ebollizione ≠ Combustione. Es: l’etanolo ha punto di ebollizione a 80°C, punto di infiammabilità a 12°C.

Dato che si usano sostanze infiammabili, si ha l’esigenza di non utilizzare fiamme libere! Quando avremo bisogno di riscaldare non si userà mai il Bunsen, ma metodi alternativi.

Comuni operazioni condotte a pressione ridotta

• Filtrazione a pressione ridotta
• Rotavapor (un distillatore, favorisce l’allontanamento dei solventi)

La vetreria deve essere integra e adatta a sostenere il vuoto che si produce.

Dispositivi di protezione individuale e collettiva

• Occhiali
• Guanti monouso
• Camice
• Cappe aspiranti

Smaltimento dei rifiuti

Niente deve essere versato nel lavandino! (a meno che non venga espressamente suggerito). Suddivisione dei rifiuti in:

• Soluzioni acquose
• Solventi alogenati (non li avremo)
• Solventi non alogenati

Cromatografia su strato sottile

TLC (Thin Layer Chromatography)

È una tecnica semplice e veloce, che richiede solo minime quantità di campione (nell’ordine dei microgrammi). Si basa sulla diversa ripartizione di sostanze tra una fase stazionaria e una fase mobile in funzione dell’affinità che ogni sostanza ha per esse.

Fase stazionaria (FS)

Materiale granulare omogeneo (es: gel di silice o allumina, sono entrambi polari, in fase diretta); RP-18 fase stazionaria apolare, è in fase inversa. Nella TLC la fase stazionaria è generalmente costituita da silice (più raramente allumina) addizionata di leganti (gesso, amido, ecc.) che viene depositato, sotto forma di strato sottile, su un supporto piano solitamente di vetro o di alluminio.

Fase mobile (FM)

Liquido che sale lo strato sottile di fase stazionaria per capillarità.

Diversi tipi di TLC

• Preparativa: cromatografia il cui obiettivo è quello di separare i componenti di una miscela dal punto di vista quantitativo. Viene fatta con grandi quantità di materiale. Lo strato sottile ha uno spessore maggiore (fino a 2 mm); la dimensione della particella è maggiore.
• Analitica: obiettivo di analizzare la miscela, verificando la sua composizione. Si utilizza una minima quantità della miscela.

HPTLC (High Performance TLC) si utilizza in casi particolari, miscele complicate da separare. Utilizza uno strato molto sottile e le dimensioni delle particelle sono molto piccole. (Noi in laboratorio utilizzeremo quella analitica)

La TLC viene principalmente impiegata per

• Seguire l’andamento di una reazione: scomparsa dei reagenti e/o comparsa di prodotti;
• Controllare il grado di purezza di una sostanza;
• Riconoscere prodotti incogniti;
• Identificare l’eluente più adatto da impiegare per una separazione cromatografica su colonna;
• Seguire l’andamento di una separazione cromatografica su colonna.

Materiale impiegato

• Lastre cromatografiche (comprate già preparate);
• Capillari per deposizione (per trasferire il campione sulla lastra);
• Eluente;
• Camera cromatografica (all’interno della quale si verifica la separazione);
• Sistema di rivelazione.

Procedure operative

Semina

1. Il campione, sciolto in opportuno solvente (soluzioni 1-2% nel solvente meno polare in cui la sostanza è solubile), viene posto sulla lastrina come una macchia (spot) utilizzando opportuni capillari di vetro. Si prende una punta di spatola del campione e si aggiunge circa 1 ml di solvente e si assicura che il campione sia sciolto. Se non è completamente sciolto si può ricorrere a un breve riscaldamento.

Trasferimento della soluzione nella lastrina tramite capillari di vetro. Si inserisce il capillare nella soluzione, che risalirà per capillarità. Poi lo si poggia sulla lastrina. Eventualmente si asciuga lo spot, per far evaporare il solvente. La semina è realizzata lungo una linea parallela al bordo inferiore della lastrina, a circa 1 cm da esso; tracciata a matita. Bisogna generare spots non troppo grandi. Se la soluzione è diluita è possibile seminare più volte nello stesso punto. Si depone il campione e si segnano i punti (con una matita).

Eluizione

La lastrina viene appoggiata verticalmente all’interno della camera di sviluppo contenente la fase mobile (eluente) assicurandosi che il livello dell’eluente sia al di sotto della macchia (se lo spot è immerso nell’eluente, viene dissolto). L’eluente risale la lastrina per capillarità e viene fatto correre fino a circa 1 cm dal bordo superiore. Durante lo sviluppo i vari componenti della miscela migrano e si separano a seconda della diverse affinità nei confronti della FM e FS. A sviluppo completato, si estrae la lastrina e si segna il livello raggiunto al fronte del solvente (con la matita), si evapora l’eluente e si passa quindi alla fase di rivelazione.

Qualora alcune sostanze non siano state completamente separate (si trovano vicine), è possibile ricorrere ad un ulteriore sviluppo multiplo (utilizzando la stessa lastrina). Non bisogna muovere la camera di eluizione! (Si avrebbe una risalita non livellata). La camera di eluizione deve essere chiusa ermeticamente sia perché i solventi sono volatili, ma soprattutto perché la camera deve essere satura. La saturazione della camera è fondamentale per la buona riuscita della separazione cromatografica. Inoltre, in una camera satura la progressione della FM avviene più velocemente. Rendendo la camera satura, si controbatte l’evaporazione del solvente dalla superficie piana della lastrina. Per garantire la saturazione, nella camera (che sono in pratica dei barattoli) vengono inseriti dei fogli di carta da filtro che si imbevono della fase mobile e quindi l’evaporazione del solvente che avviene dalla carta da filtro garantisce la saturazione della camera.

Le sostanze si spostano in funzione della loro polarità e di quella dell’eluente. In presenza di una TLC in fase diretta (adsorbenti più polari rispetto alla FM) le sostanze più polari avanzano più lentamente di quelle meno polari. Se si utilizza una TLC in fase inversa (apolare), le componenti più trattenuti sono quelli polari e quelli che migrano maggiormente sono quello polari. Il gel di silice è polare dal momento che in superficie il polimero di biossido di silicio espone sia gruppi silossanici (Si-O-Si) polarizzati, sia dei silanoli (gruppi funzionali Si-OH). Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in grado di interagire con i gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono principalmente dipolo-dipolo e legami a idrogeno, e quindi quanto più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria.

Per esempio, se si ha una miscela di alcol benzoico, benzaldeide e un alchene generico:

• Alcol benzoico: dà interazioni sia come accettore che come donatore di ponte a idrogeno - il più trattenuto
• Benzaldeide: accettore di ponti a idrogeno
• Alchene: non dà interazioni - il più avanti

Nella TLC la fase mobile è un liquido, o una miscela di liquidi, scelti per lo sviluppo e la sua migrazione avviene per capillarità ascensionale. La FM dovrà avere caratteristiche tali da competere opportunamente con il soluto per l’adsorbimento sulla fase stazionaria. Se la competizione è efficace, il soluto passa più tempo nella fase liquida e scorre di più. In alcuni casi è opportuno aggiungere un acido o una base organica (rispettivamente per eluire acidi e basi fortemente trattenuti). Il potere di sviluppo è direttamente proporzionale alla polarità della sostanza. Alto potere di sviluppo: permettono una maggior risoluzione. Es: Metanolo ha elevata affinità per il gel di silice, quindi si associa fortemente ad esso e di conseguenza sposta gli analiti maggiormente nella FM. (Maggiore migrazione) Migrano troppo, tutti al fronte. Invece utilizzando un solvente troppo poco polare, gli analiti non migrano.

Ordine di eluizione su gel di silice

La differente affinità che ciascuna sostanza organica ha nei confronti della FM e della FS è una caratteristica intrinseca di ciascun composto organico, dipendente da: polarità, dimensione e volume delle molecole. Pertanto alcune sostanze sono trascinate maggiormente ed altre in misura minore a parità di fase mobile, permettendo di effettuare una completa separazione dei composti costituenti la miscela. Sostanze più polari, come gli acidi carbossilici, saranno quelli maggiormente trattenuti (sono quindi quelle più adsorbite dal gel di silice). Ciò però non significa che un acido carbossilico rimarrà sempre confinato alla base; se io ho una sostanza polare e voglio farla migrare maggiormente devo utilizzare un eluente più polare. Trovare, a parità di FS, l’eluente più opportuno.

Rivelazione

Se i componenti della miscela non sono direttamente visibili (assorbono nel visibile) bisogna utilizzare opportuni metodi di rivelazione, come ad esempio l’irraggiamento della lastrina con lampade UV che emettono a 254 e 366 nm.

• Sostanze fluorescenti: macchie luminose su fondo scuro.
• Sostanze non fluorescenti (la maggior parte) la FS deve contenere una sostanza fluorescente (silicato di zinco e magnesio attivato: assorbe UV a 254 nm ed emette luce verde) macchie scure su fondo fluorescente.

Questo metodo è utile per le sostanze che assorbono alla lunghezza d’onda di 254 nm. Potrebbero però anche essere presenti molecole che non assorbono a questa lunghezza d’onda, e quindi con questo sistema di rivelazione non si vedranno. Si utilizza quindi anche un altro tipo di rivelazione, con agenti chimici.

Reattivi di uso generale

• Iodio: utile per rivelare sostanze che contengono doppi legami e che formano complessi a trasferimento di carica con lo iodio - spots giallo-marroni.
• Acido solforico in etanolo: che viene spruzzato sulla lastra poi viene portata a calore, le sostanze vengono così carbonizzate - spots scuri su fondo bianco.
• Permanganato di potassio in soda: reattivo ossidante che porta alla formazione di macchie scure (di permanganato) la lastrina appare viola e le macchie giallo-marroni.
• Sali di molibdeno e di cerio: reattivo ossidante - macchie blu-viola su fondo giallo.

Spesso si porta anche a riscaldare, utilizzando una pistola termica (fonte di calore diretto e preciso che arriva fino a 600°C). Permanganato più ossidante rispetto ai sali di molibdeno e cerio.

Reattivi specifici (che noi non useremo) per gruppi funzionali

• Ninidrina: per amminoacidi
• 2,4-dinitrofenilidrazina: per aldeidi e chetoni

Fattore di ritenzione

Calcolare per ogni sostanza il fattore di ritenzione (Rf): Rappresenta la mobilità cromatografica. Rapporto tra distanza percorsa dalla sostanza e quella percorsa dal solvente. Il valore è compreso tra 0 (sostanza completamente trattenuta dall’adsorbente) e 1 (sostanza non trattenuta che migra fino al fronte) e viene espresso fino alla seconda cifra decimale.

La capacità di separare una sostanza di interesse da altri componenti interferenti (selettività) permettendone una identificazione inequivocabile, in una TLC è legata alla mobilità cromatografica dei componenti della miscela, ed è espressa dal fattore di ritenzione (o fattore di ritardo; Rf).

Fattori che influenzano l’Rf:

• Uniformità delle particelle e spessore della FS;
• Temperatura che può influenzare la composizione della FM;
• Grado di saturazione della camera di sviluppo;
• Quantità di miscela da separare seminata.

Quindi, non è semplice utilizzare questo parametro per poter identificare una sostanza in due TLC differenti (poiché appunto l’Rf dipende e varia a seconda di diversi fattori). Per questa ragione, per effettuare un’analisi identificativa di una sostanza tramite TLC è necessario seminare, sulla medesima lastrina accanto alla miscela in esame, i componenti puri (standards) che ci si aspetta di trovare, effettuando il riconoscimento per confronto diretto tra gli Rf degli spot incogniti con quelli degli standards seminati (in questo modo sia la miscela in esame che gli standards risentiranno delle stesse condizioni). In questo modo, se otteniamo due Rf uguali, abbiamo alte probabilità che le due sostanze siano la medesima molecola. Però in realtà diverse sostanze possono avere Rf uguali. Non è quindi una certezza (bisognerà ricorrere ad altri metodi analitici).

A volte si possono avere delle situazioni ambigue, in cui ad esempio due sostanze sono molto vicine ma non sono perfettamente allineate: si tratta di due sostanze diverse o della medesima sostanza?

TLC in miscela

In questo caso, per identificare il composto può essere utile eseguire una TLC in miscela (o double spotting, o co-spotting) che richiede tre semine:

1. Il composto da identificare,
2. Il campione di riferimento,
3. Una miscela dei due.

In questo caso posso avere due risultati diversi:

• Nel punto di semina della miscela vedo che ci sono due macchie (separate di poco, ma comunque sono due macchie) - ho due sostanze diverse con Rf molto simili;
• Nel punto di semina della miscela vedo un’unica macchia - le due sostanze sono la medesima.