Genetica umana

Genetica umana

Introduzione

Il DNA contenuto nel nucleo di una cellula eucariotica (es. cellula dell’uomo) non è una lunghissima molecola lineare, ma è suddiviso in porzioni di molecole di DNA lineari che prendono il nome di cromosomi. Questo DNA nucleare non è nudo, ma è complessato a proteine. Quindi i cromosomi sono costituiti dall’associazione della molecola di DNA (doppia elica lineare) con le proteine (la quantità in peso delle proteine è circa doppia rispetto a quella del DNA). Questa associazione tra DNA e proteine è indicata con il termine cromatina.

Il numero di cromosomi presenti in una cellula è indicato con la lettera "n" e varia da cellula a cellula. In particolare il numero di cromosomi presenti in una cellula umana è pari a 23, ma l’uomo è un organismo diploide, cioè presenta un contenuto doppio di cromosomi ed è per questo che riferendoci all’organismo diploide parliamo di 46 cromosomi, cioè "2n" (moltiplico x 2). Infine la lettera "C" si riferisce al contenuto totale di DNA nella cellula e questo nell’uomo, riferendoci alla condizione aploide, è pari a 2,75 x 10⁹ pb o 3,5 pg.

Negli organismi superiori non c’è correlazione tra il contenuto del DNA (numero di pb del DNA) e la complessità dell’organismo e questa mancata correlazione prende il nome di "paradosso del valore C". Infatti se questa correlazione esistesse, nell’uomo dovremmo avere un DNA con un numero di pb superiore a quello di altri organismi, ma questo non si verifica e spesso altri organismi hanno un maggiore numero di pb rispetto all’uomo (l’uomo ha un DNA di 94 cm nella condizione aploide). Per questo gli anfibi (es. rane) hanno un maggiore contenuto di DNA rispetto all’uomo.

Nonostante questa correlazione sia assente nelle specie più complesse, essa è presente nei batteri e nelle specie più semplici. La molecola di DNA può essere contenuta nella cellula grazie al fatto che subisce alcune modificazioni che ne determinano la condensazione, in modo da formare i cromosomi. Inizialmente il DNA si accorcia e si ingrossa, cioè si riduce in lunghezza e aumenta in altezza, per cui la doppia elica via via sale, passando da 2 nm a 11 nm, poi a 300 nm, poi a 700 nm ed infine a 1400 nm.

In questo modo ciascuna molecola di DNA viene impacchettata in un cromosoma metafasico, che rappresenta il massimo grado di condensazione dei cromosomi (1400 nm). Il cromosoma metafasico quindi è una struttura molto complessa che si forma durante la metafase della mitosi e rappresenta l’unico momento in cui al microscopio ottico si possono osservare i cromosomi. Tutte le tappe precedenti di condensazione, invece, si possono osservare solo al microscopio elettronico. Questo vuol dire che quindi nella cellula non esiste la molecola di DNA nuda, la quale può essere estratta solo in laboratorio, eliminando le proteine a cui il DNA è legato.

Processo di condensazione del DNA

Analizziamo il processo di condensazione del DNA più nel dettaglio. Inizialmente 145 o 146 pb del DNA (DNA=rosso) si avvolgono attorno ad un ottamero, ovvero un gruppo di 8 proteine istoniche che formano una struttura a forma di cilindro appiattito chiamata core. Le proteine istoniche sono piccole, globulari, con molta capacità di aggregarsi tra loro e le più conservate nel corso dell’evoluzione, poiché in tutte le specie il DNA si lega agli istoni. In totale esistono 4 tipi di istoni (H2A, H2B, H3 e H4), quindi l’ottamero è fatto dai 4 tipi di istoni, ciascuno in forma duplicata (2H2A, 2H2B, 2H3 e 2H4).

Questo complesso costituito da DNA e proteine istoniche prende il nome di nucleosoma e rappresenta il primo grado di condensazione del DNA. Una volta che il nucleosoma si è formato, esso si lega ad un’altra proteina istonica detta H1. Inoltre i nucleosomi sono separati l’uno dall’altro da un tratto di DNA detto DNA di connessione (o DNA linker). Tuttavia l’istone H1 ha una grande capacità di autoaggregazione, per cui tende a legare un altro istone H1 e si verifica per questo l’eliminazione del DNA connessione compreso tra i 2 nucleosomi. Quindi l’istone H1 di ciascun nucleosoma lega l’istone H1 del nucleosoma successivo e scompare il DNA linker tra essi compreso.

Queste strutture sono state osservate al microscopio elettronico: inizialmente si osservano i nucleosomi distanti l’uno dall’altro (punti neri), poiché è ancora presente il DNA linker tra essi compreso e questa disposizione è nota come collana di perle, poiché le perle corrispondono ai nucleosomi, mentre il filo che le collega corrisponde al DNA linker. Quando gli istoni H1 si legano tra loro, i nucleosomi si avvicinano e scompare il DNA linker (porzione nuda di DNA) per cui si forma la fibra di cromatina (30 nm), contenente 6-7 nucleosomi per ogni giro.

Tuttavia questo grado di condensazione non è sufficiente a compattare il DNA, quindi specifiche regioni di cromatina stabiliscono interazioni con l’impalcatura proteica del nucleo, cioè con le proteine della matrice nucleare (diverse dalle proteine istoniche) e così tutte le porzioni di DNA comprese tra questi siti di legame si sollevano a formare dei loop, cioè delle anse. Quindi dalla fibra cromatidica si passa alle anse cromosomiche. L’insieme di tutte le anse legate all’impalcatura proteica del nucleo complessivamente forma una struttura a rosette, cioè le anse sono simili ai petali di un fiore legati alla zona centrale proteica. La struttura ad anse cromosomiche precede il cromosoma metafasico, cioè è presente nelle cellule che non sono in divisione, poiché invece durante la divisione mitotica le rosette si avvicinano l’una all’altra formando un fascio compatto che caratterizza il cromosoma metafasico. Per questo osservando il cromosoma metafasico al microscopio elettronico è possibile notare come esso sia ingrossato, cioè condensato rispetto al DNA.

Ciclo cellulare

Il ciclo cellulare è l’intervallo di tempo che intercorre tra una divisione cellulare e l’altra ed ha l’obiettivo di generare, a partire da una cellula madre, due cellule figlie identiche tra loro e identiche alla cellula madre. La divisione cellulare è un processo legato al differenziamento cellulare, cioè la cellula staminale totipotente si divide quando deve maturare, per differenziare nella cellula adulta con un suo compito (es. muscolare, neuronale, ecc…). Arrivate a maturazione poi queste cellule non si dividono più, a meno che non siano stimolate in laboratorio o con stimoli ambientali di vario genere.

Durante il ciclo cellulare avviene quindi la mitosi (M), cioè la divisione che caratterizza le cellule somatiche del nostro organismo ed il periodo del ciclo cellulare compreso tra una mitosi e l’altra prende il nome di interfase. L’interfase è a sua volta composta da più fasi: fase G1 (G=gap, è la fase che avviene subito dopo la mitosi e prepara la cellula alla duplicazione dei cromosomi), fase S (fase di sintesi con duplicazione del DNA), fase G2 (G=gap, si verifica prima che la cellula entri in mitosi, cioè è la fase che prepara la cellula alla mitosi).

Mentre la mitosi ha la durata di un’ora in tutti i tipi cellulari, le altre fasi del ciclo cellulare, cioè fase G1, G2 ed S, hanno una durata variabile a seconda della cellula considerata. Ad esempio la fase S (di sintesi), cioè la fase in cui avviene la duplicazione del DNA, è rapida nelle cellule embrionali che devono dividersi rapidamente e quindi sintetizzare rapidamente il DNA, mentre è molto più corta nelle cellule adulte. Poi abbiamo la fase G1 che dura da qualche giorno a qualche ora e la fase G2 che è un po’ meno variabile, poiché dura dalle 2 alle 4 ore.

Alcune cellule smettono di dividersi, cioè per esse la fase G1 diventa permanente e prende per questo il nome di fase G0 (forma permanente della fase G1). In alcuni casi, invece, la cellula si blocca in mitosi e la riavvia solo successivamente (ad es. il linfociti che normalmente sono quiescenti e che riprendono a dividersi grazie ad uno stimolo antigenico).

La fase S è la fase di duplicazione del DNA. Si parte da una doppia elica di DNA che va incontro a duplicazione semi-conservativa, cioè ogni filamento della doppia elica funge da stampo per la sintesi di un nuovo filamento. In questo modo si ottengono i due filamenti duplicati, che sono tenuti insieme in corrispondenza di un punto detto centromero. Nella cellula però non abbiamo una doppia elica di DNA lineare, ma un filamento compattato che prende il nome di cromosoma e che all’inizio della fase di sintesi è costituito da un solo cromatidio. Di conseguenza quando questo si duplica si ottiene un cromosoma costituito da 2 cromatidi tenuti insieme dal centromero.

Il raddoppio del cromosoma in 2 cromatidi si verifica perché la cellula deve dividersi in 2 cellule figlie e quindi il DNA deve raddoppiare per essere distribuito alle 2 cellule figlie, grazie alla divisione dei cromatidi durante la mitosi, o altrimenti si avrebbe la perdita di materiale. Quindi durante la fase G1 (dopo la mitosi) si parte da un contenuto di DNA classificato come 2C = diploide (diverso da 1C = aploide, presente nei batteri), quindi da 46 cromosomi fatti da un solo cromatidio. Nella fase S si ha la duplicazione del DNA, cioè si ottengono i 46 cromosomi, ciascuno fatto da 2 cromatidi, e quindi si passa da 2C a 4C e questo persiste anche nella fase G2, fino a quando non avviene la separazione dei 2 cromatidi di ciascun cromosoma nelle 2 cellule figlie durante la mitosi, senza perdita di materiale (2C per ciascuna cellula figlia, quindi 2C x 2C = 4C).

La mitosi può essere suddivisa in più fasi: prometafase, metafase, anafase (i cromosomi iniziano a disporsi ai 2 poli opposti della cellula) e telofase (separazione delle 2 cellule). Durante la mitosi, cioè durante la separazione dei cromatidi, si verifica la progressiva condensazione dei cromosomi. Quindi inizialmente la cellula ha il nucleo in interfase, con il DNA disposto a formare anse e rosette; via via che procede la divisione mitotica aumenta il grado di condensazione, cioè si passa dalle rosette ad un fascio di rosette, fino ad arrivare ai cromosomi metafasici, che rappresentano il massimo grado di condensazione e che si possono osservare al microscopio ottico.

Superata la metafase poi i cromosomi vanno di nuovo incontro a decondensazione, cioè si ottiene la cromatina interfasica, quindi cromosomi più despiralizzati a rosette (non più fascio di rosette). Più nel dettaglio si parte dal nucleo interfasico (A) nel quale i cromosomi sono un po’ despiralizzati. Si avvia la fase G1 a cui segue la fase S, durante la quale i cromosomi si duplicano in 2 cromatidi uniti dal centromero, continuando a rimanere despiralizzati, anche nella fase G2. Ha inizio quindi la mitosi e durante la profase i cromosomi, fatti sempre dai 2 cromatidi, vanno incontro a condensazione. Segue la metafase, durante la quale i cromosomi vanno al centro del nucleo raggiungendo il massimo grado di condensazione. Infine i cromatidi di ciascun cromosoma si dirigono ai poli opposti della cellula e simultaneamente anche la cellula stessa si divide. In questo modo la mitosi termina e i cromosomi despiralizzano per ritornare nella struttura interfasica.

In una cellula diploide ci sono 2 copie di ogni cromosoma. Per questo partendo da 2 cromosomi dovremo considerare che essi sono 4 (uguali a 2 a 2). Supponiamo in particolare di avere 2 cromosomi uguali tra loro più lunghi e 2 cromosomi uguali tra loro più corti. In ciascuna coppia i cromosomi sono uno bianco e uno nero perché possono essere distinti in base alla provenienza, cioè quello bianco è di origine materna, mentre quello nero è di origine paterna (questo perché la cellula uovo viene fecondata da uno spermatozoo). Subito prima della mitosi questi cromosomi si duplicano e quindi ciascuno dei 4 sarà costituito da 2 cromatidi. Si avvia la mitosi e durante la metafase questi cromosomi raggiungono il massimo grado di condensazione, disponendosi al centro del nucleo sulla piastra metafasica, uno dietro l’altro.

In questo modo le fibre del fuso mitotico si legano al centromero di ciascun cromosoma, permettendo la separazione dei 2 cromatidi per ciascuno di essi (qui si tratta di 4 cromosomi all’interno della cellula, ma anche se fossero 80 o 90 per ciascuno di essi ci sarebbe la separazione dei cromatidi). Alla fine della mitosi si ottengono quindi le 2 cellule figlie uguali tra loro e uguali alla cellula di partenza.

Abbiamo detto che la mitosi accompagna il differenziamento cellulare ed è molto importante per la duplicazione delle cellule. Tuttavia la mitosi è anche sfruttata per l’osservazione al microscopio dei cromosomi in metafase, poiché questi presentano il massimo grado di condensazione. Queste osservazioni sono fondamentali poiché ciascuna specie possiede lo stesso tipo e lo stesso numero di cromosomi e se si osservano delle alterazioni vuol dire che siamo in presenza di una patologia (ad es. la sindrome di Down o trisomia 21 è dovuta ad alterazioni di 3 cromosomi metafasici e quindi può essere rilevata solo in cellule che si dividono).

Studi citogenetici

Per questi studi citogenetici possono essere utilizzati diversi tipi di tessuto: tessuti pre-natali e tessuti post-natali.

• Tessuti pre-natali si dividono facilmente, cioè sono costituiti da cellule in attiva divisione che devono dare origine ad un individuo. Tra questi tessuti quelli che possono essere usati per le analisi prenatali sono: cellule del liquido amniotico, villi coriali e linfociti di sangue fetale. Inoltre in caso di aborto o di morte del feto per l’indagine sui cromosomi possono anche essere usati dei prodotti abortivi, ovvero: placenta, pelle, polmone, rene. In ogni caso i tessuti pre-natali sono costituiti da cellule che si dividono continuamente, per cui la procedura è semplice.
• Tessuti post-natali devono essere selezionati. Molto comunemente per osservare i cromosomi si utilizzano i linfociti del sangue periferico, poiché questo è un tessuto ottenibile facilmente con un prelievo di 500 µl. Per osservare l’assetto dei cromosomi in soggetti affetti da leucemia, invece, si utilizzano le cellule del midollo osseo. Un altro tessuto utilizzato è la pelle, le cui cellule si ottengono tramite un prelievo ascellare e poi poste in coltura si dividono. Infine anche i tessuti tumorali possono essere utilizzati, poiché i tumori sono proprio cellule in continua proliferazione.

A prescindere dal tessuto di provenienza, per allestire la procedura, le cellule eucariotiche devono essere messe in contatto con un terreno di coltura. Questo perché le cellule eucariotiche non sono in grado di sintetizzare da sole i prodotti per la loro sopravvivenza e necessitano per questo di terreni di coltura arricchiti (es. MEM, RPMI 1640, TC199, McCoy 5A). Questi terreni si acquistano dalle ditte e sono fatti da una serie di componenti: siero di bovino fetale (fonte di proteine), vitamine, amminoacidi essenziali, glucosio, ecc… cioè tutti elementi essenziali per la sopravvivenza delle cellule in coltura. Alcune volte al terreno si aggiungono anche antibiotici e questo per far sì che le cellule siano sterili e per evitare la contaminazione.

Esistono 2 tipi di colture cellulari: colture in sospensione e colture in monostrato. Le colture in sospensione sono rappresentate da cellule sospese nel terreno di coltura (es. linfociti); le colture in monostrato, invece, sono rappresentate da cellule che hanno bisogno di aderire ad un substrato per crescere (es. fibroblasti e cellule epitelioidi).

Le colture cellulari possono anche essere distinte in base alla durata. In particolare abbiamo le colture a breve termine = Short-term culture, dove le cellule sopravvivono nel terreno di coltura al massimo per 3 giorni (es. linfociti, linfonodi o cellule del midollo osseo), e le colture a lungo termine = Long-term culture, dove le cellule sopravvivono anche oltre i 3 giorni nel terreno di coltura (es. cellule della pelle, del liquido amniotico e cellule mesenchimali dei villi coriali). Poi ci sono le cellule tumorali che crescono all’infinito perché proliferano continuamente.

I villi coriali o il liquido amniotico possono essere utilizzati per la diagnosi prenatale, cioè per l’osservazione dell’assetto dei cromosomi nel feto nel caso in cui la madre presenti dei parametri alterati o nel caso in cui abbia un’età avanzata (rischio di sindrome di Down). La procedura prevede che un’équipe medica effettui un prelievo dei villi coriali all’8a-10a settimana di gestazione o un prelievo del liquido amniotico alla 12a-16a settimana di gestazione (prima questo prelievo poteva causare la morte del feto, mentre ora i sistemi sono più standardizzati). Il liquido amniotico prelevato viene poi posto in provetta, sottoposto a centrifugazione e a questo punto le cellule vengono poste in colture in modo da effettuare l’analisi dei cromosomi.

Tutti i laboratori mettono in atto analisi citogenetiche con procedure standard per osservare i...