Genetica medica

Genetica medica

A.A. 2020-2021 Parte 1 Genetica medica Sestini Roberta,

Introduzione alla genetica medica

Introduzione alla genetica medica (lez.1 - 02/10) genetica oncologica.

Una parte fondamentale della genetica medica è di andare a studiare la genetica oncologica. È importante conoscere le metodiche di analisi e indagini genetiche pre e post-natale, soprattutto per studiare numero e cariotipi struttura dei cromosomi. Parliamo quindi dei cromosomi che vengono resi colorati per averli visibili e che sono fatte sulla base di tecniche più o meno recenti. Quando abbiamo a che fare con malattie genetiche, le tecniche utilizzate sono sicuramente diverse e quindi una parte del corso sarà deputata a cercare di capire quali sono le metodiche, come funzionano e quando possono e devono essere utilizzate.

Il programma si articola in citogenetica, citogenetica molecolare, cenni sulla trasmissione dei caratteri fenotipici e la patologia molecolare del gene, come le mutazioni hanno effetto sul fenotipo e quale è l’effetto biologico. Poi nella seconda parte del corso vedremo l’analisi molecolare degli acidi nucleici (analisi DNA e RNA), vedremo le alterazioni genetiche del tessuto tumorale e poi i linkage.

Patologia genetica

La patologia genetica studia tutti quei fenomeni patologici che hanno un’alterazione del DNA alla base. Sono alterazioni che possono coinvolgere un singolo o più nucleotidi fino a interessare parte o tutto un cromosoma. Le malattie di pertinenza sono le malattie genetiche, ereditarie e congenite. Queste tre definizioni sembrano sinonimi, ma non è così:

• Malattie genetiche comprendono quelle condizioni patologiche a carico del patrimonio genetico, e possono essere o ereditarie o non ereditarie. Quindi riguarda solo l’alterazione del DNA, fattore scatenante della malattia. Quindi non si può stabilire a priori se è o meno ereditaria, o congenita.
• Malattia ereditaria deriva per linea genitoriale e trasmessa tramite cellule germinali nelle diverse generazioni e sono quindi familiari. Non tutte le malattie ereditarie si manifestano nel momento della nascita, ma possono insorgere in fasi successive della vita.
• Malattie congenite, possono essere o meno ereditarie, e sono quelle i cui sintomi si riscontrano al momento della nascita. Alcune sono o meno ereditarie e vengono rese tali per l’arrivo di agenti patogeni per esempio nella vita intra-uterina dando alterazione organica nel feto. Quindi queste malattie quindi possono essere o meno genetiche.

Potremo allora pensare che certe malattie genetiche sono a appannaggio di solo alcune famiglie, ma ci sarà il primo evento mutazionale. Il primo soggetto affetto della famiglia che presenta una malattia genetica ereditaria, è un soggetto che è andato incontro a una mutazione de novo, termine con cui indichiamo mutazione in un soggetto affetto, ma in nessuno dei due genitori. È quindi il primo caso della famiglia in cui appare la mutazione.

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I motivi per cui questo succede sono tre fondamentalmente:

• Difetto genetico post-zigotico, quindi insorto nelle fasi replicative precoci delle cellule dopo embrionali alla fecondazione tra spermatozoo e ovulo, e, come tale, sarà presente soltanto in alcune cellule del soggetto affetto. Si parla allora in tal caso di mutazione somatica del soggetto affetto.
• Difetto genetico pre-zigotico, e quindi la mutazione avviene prima che si formi lo zigote. La mutazione insorge casualmente in uno dei due gameti, maschile o femminile. L’individuo che si genera sarà portatore della mutazione in tutte le sue cellule.
• Difetto genetico pre-zigotico, nel genitore non c’è (presente in uno dei due genitori) ma mutazione. Succede perché il genitore è portatore solo in alcune cellule delle gonadi, e queste danno origine a gameti portatori della mutazione, ma sulle cellule del sangue per esempio su cui si fa comunemente i test genetici non troviamo la mutazione, parliamo di mosaicismo somatico parentale.

Malattie mendeliane, cromosomiche e multifattoriali

Quali sono le malattie che possiamo trovare che avanti studieremo e ritroveremo? In realtà se vediamo il sito OMIM™ che ci dà solo le malattie mendeliane, sono circa 25.000, ma le malattie non sono quelle monogeniche mendeliane, ma anche cromosomiche date dalla perdita o acquisto di un intero cromosoma o parti di esso che riguardano alterazioni in numero e struttura del cromosoma. Inoltre abbiamo anche malattie poligeniche/multifattoriali che derivano dall’interazione tra più geni nessuno dei quali ha azione importante nel determinare il fenotipo malattia e perché sia sviluppata la malattia devono concorrere fattori genetici predisponenti e altri fattori come suscettibilità ambientale.

Queste malattie sono malattie comuni, a differenza delle cromosomiche e monogeniche che sono rare. Per dire rara una malattia, diciamo si attribuisce quando la sua prevalenza, intesa come numero di casi presenti su una data popolazione, non supera una soglia fissata. Per la comunità europea questa soglia è 0,05 quindi si definisce rara se non supera 5 casi su 10.000 persone.

L’80% delle malattie rare ha origine genetica coinvolgendo uno o più geni, o qualche cromosoma. Possono essere ereditarie o derivare da mutazioni de novo, e come incidenza nel loro complesso colpiscono il 3-4% dei nati vivi. Ci sono anche malattie rare non su base genetiche, ma anche provocate da infezioni (batteriche o virali) o anche da fattori degenerativi, proliferativi ecc... o anche che derivano da interazione causa genetica-ambiente.

Le malattie rare hanno un enorme impatto sul sistema medico nazionale. Circa il 50% degli aborti spontanei sono da ricondurre a alterazioni genetiche presenti nel feto che rendono incompatibile lo sviluppo fetale con la vita. Circa l’1% dei nati vivi presenta alterazioni cromosomiche in numero e struttura, e una percentuale che si attesta al 5% di persone al di sotto di 25 che sviluppano malattie conducibili a disordini genetici, ereditari, o dati da cause multifattoriali.

Una classificazione che facciamo sulle malattie genetiche è relativo all’età di comparsa della malattia. Le malattie letali nella vita pre-natale che danno aborto, sono solitamente malattie dovute a aberrazioni cromosomiche che rendono incompatibile lo sviluppo del feto.

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Tutte quelle che compaiono e manifestano i sintomi o prima della nascita o subito dopo, possono essere date da aberrazioni meno importanti (nel senso di incompatibilità vitale), per esempio la trisomia 21, oppure invece la monosomia 21 che è completamente incompatibile con la vita. Altre malattie come la trisomia 21 fino all’età adulta si ha la vita, la trisomia 13 o 18 invece si ha una interruzione della vita nelle fase precoci dell’infanzia. Altre malattie come quella della fibrosi cistica o la fenilchetonuria si notano subito dopo la nascita.

Mutazioni genomiche, cromosomiche e genetiche

Le malattie di pertinenza della genetica sono, tutte quelle malattie date da mutazioni genomiche in cui il soggetto presenta numero di cromosomi diverso da 46, dove il cromosoma sovrannumerario o mancante, può essere un autosoma o uno sessuale e raramente sono ereditarie. Abbiamo poi le mutazioni dette mutazioni cromosomiche, che comprendono quelle alterazioni della struttura cromosomica, traslocazione, delezione, traslocazione robertsoniana ecc... che danno alterazione della forma di uno o più cromosomi. E sono ereditarie o no. Le mutazioni genetiche sono invece date da delezioni, inserzioni, mutazioni puntiformi ecc.... a carico di pochi nucleotidi e che coinvolgono un singolo gene. L’eredità avviene allora sia in modo mendeliano, o non mendeliano quando abbiamo espansione di triplette o abbiamo mutazioni mitocondriali.

Le malattie su cui si sospetta una base ereditaria sono studiate tramite i pedigree ricostruendo l’albero genealogico cercando di ricostruire la genealogia per ascendenti e discendenti. Ci dà info iniziali per la trasmissione della malattia. Una volta identificata quale può essere la malattia e categorizzata come genetica o cromosomica, verrà fatta analisi del cariotipo, se sospetto che sia cromosomica, o uno studio a livello del singolo gene se sospetto che sia a carico di un gene.

Cariotipo e citogenetica

Parliamo allora di cosa è il cariotipo, ovvero la serie completa di cromosomi di una cellula di una specie o di un organismo. È il metodo di analisi per valutare alterazione di numero di cromosomi, o per valutare in generale le alterazioni genomiche o cromosomiche. Il cariotipo si definisce da numero e morfologia di tutti i cromosomi presenti nel nucleo della cellula di un organismo. Viene fatta a microscopio ottico e si fa determinando il numero cromosomico, ma non solo. Identifico anche la lunghezza, posizione del centromero, distribuzione caratteristica di bande chiaro-scure (pattern di bandeggio), i cromosomi sessuali e il tutto con lo scopo finale di valutare la presenza di alterazioni numeriche e strutturali rispetto al cariotipo standard di una specie. Allora la citogenetica è lo studio dei cromosomi e della loro struttura.

I cromosomi sono detti anche corpi colorati, che durante il ciclo cellulare si replicano e formano due cromatidi legati da una strozzatura detta centromero con cui posso identificare un braccio corto (p) e uno braccio lungo (q) di ogni cromatide, che compone il cromosoma. Ogni cromosoma è fatto da DNA e proteine sia con funzione strutturale che funzionale per definire i livelli di spiralizzazione e impaccamento del DNA. Le principali proteine sono gli istoni che con il DNA genera la cromatina. Ci sono vari livelli di spiralizzazione del DNA generati dalle proteine del DNA e che generano proprio il cromosoma. Quindi abbiamo il DNA spiralizzato a doppia elica che subisce avvolgimenti sempre più specifici per arrivare alla fibra da 1400 nm che corrisponde al cromosoma condensato, l’elemento che viene studiato con la citogenetica. Il grado di spiralizzazione è basso nel nucleo in interfase, aumenta invece nelle fasi iniziali della mitosi dando luogo alla comparsa dei cromosomi rendendoli visibili durante soltanto la metafase.

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Un cromosoma in metafase ha due cromatidi fratelli, ha una strozzatura centrale, e ha un braccio lungo e uno corto. Non tutte le regioni sono colorate ugualmente. Questo corrisponde ai diversi livelli di impacchettamento del DNA, là dove è meno e dove è più spiralizzato. Le regioni in cui i cromosomi spiralizzati assorbono meno colorante sono quelle eucromatiche. Quelle in cui il colorante è maggiormente assorbito sono le regioni più spiralizzate e sono le eterocromatiche. Queste sono rappresentate dai telomeri e il centromero. La eterocromatina è inattiva trascrizionalmente e contiene DNA altamente ripetuto. L’eucromatina è relativamente condensata e distribuita in tutto il nucleo e circa il 10% contiene geni trascritti attivamente.

In metafase ogni cromosoma ha i due cromatidi fratelli tenuti insieme dal centromero (o costrizione primaria). Possono esserci costrizioni secondarie che identificano regioni più telomeriche e sono dette satelliti.

Elementi fondamentali del cromosoma

Il cromosoma ha per la sua stabilità tre elementi e regioni fondamentali per mantenere e conservare la stabilità di questa struttura. Questi elementi sono:

• Origini di replicazione, sono più regioni di DNA in diversi punti del cromosoma e sono quelle in cui inizia la duplicazione del DNA in entrambe le direzioni durante l’interfase. Sono tante e disperse. Sono dette ARS e sono sequenze che danno inizio alla replicazione del DNA, possibile perché vi si legano proteine che formano un complesso di pre-replicazione in grado di reclutare le proteine coinvolte nella replicazione del DNA. Negli eucarioti ci sono tante ARS per ogni cromosoma.
• Centromero, è la strozzatura centrale che è il sito di attacco per i microtubuli del fuso. È una regione specifica del cromosoma eucariotico. Viene detta costrizione primaria perché nella metafase sembra che a livello del centromero si assista a un assottigliamento del DNA. Il centromero è fatto di DNA particolarmente ripetuto non codificante, e difatti è eterocromatico. L’organizzazione dei centromeri dipende dalla specie che considero. Nell’uomo per esempio il centromero è fatto da DNA ripetuto migliaia di volte e l’unità base è un’unità di 171 pb, ovvero una sequenza specifica in termini proprio di sequenza di basi. La funzione è di tipo strutturale e coinvolge la segregazione cromosomica perché il centromero si associa al cinetocore, complesso a ponte tra microtubuli e fuso mitotico. Il cinetocore permette la segregazione dei cromatidi fratelli nell’anafase 1 o 2 della meiosi o anafase mitotica. È allora una struttura indispensabile il centromero negli eucarioti, anche perché consente di tenere uniti i cromatidi fratelli fino alla metafase. Per poter funzionare in modo corretto ogni cromosoma deve avere un solo centromero. Se per un qualche motivo un cromosoma ha due centromeri, e diventa di-centrico, fa sì che il cromosoma si ripartisca in modo anomalo nella meiosi, dando formazione di cellule figlie con corredo sbilanciato. A seconda delle diverse specie che si può considerare, possiamo vedere che la struttura è sempre la stessa sicuramente, ma in S. Cerevisiea non c’è ripetizione e è solo una regione da 125 pb, fino a arrivare all’Homo Sapiens con tantissime ripetizione fino a raggiungere in totale addirittura le 40.000 paia di basi.

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Il centromero possiamo vedere 3 domini:

• Centrale, fatto da DNA centromerico, quindi fatte dall’unità base ripetuta DNA satellite.
• Appaiamento, comprende la parte centrale dove i cromatidi fratelli si appaiono mediante specifiche proteine come le INCEP (Inner CENtromeric protein).
• Cinetocore, è il sito di attacco dei microtubuli del fuso mitotico. Svolge funzioni indispensabili alla mitosi e meiosi.

In base alla posizione del centromero però possiamo parlare di cromosomi metacentrici quando il centromero è esattamente a metà del cromosoma. Sono sub metacentrici se è posizionato in una parte sub-terminale, che ci fanno identificare realmente un braccio corto e lungo, che non c’è nel cromosoma metacentrico. Infine si parla di cromosoma acrocentrico se il centromero è a un’estremità del cromosoma, e identifico solo un braccio lungo, non c’è il corto. Gli acrocentici possono presentare al posto del braccio corto delle strutture dette satelliti e quindi si chiamano satellitati. I cromosomi umani si classificano proprio su questa base in diversi gruppi. I cromosomi 1, 2 e 3, ma anche i 16, 17, 18, 10 e 20 sono metacentrici. Quelli dal 4 al 12, più l’X sono sub-metacentrici, mentre i 13, 14, 15 e 21, 22 e l’Y sono detti acrocentrici. I primi tre grandi acrocentrici, gli ultimi piccoli acrocentrici.

• Telomeri, sono le due regioni che sono alla fine del braccio p e q e sono cappucci che chiudono il cromosoma alle estremità. Sono delle regioni fatte da DNA altamente ripetuto non codificante. Sono strutture specializzate fatte da DNA e proteine che rivestono i cromosomi eucariotici. Sono indispensabili all’integrità del cromosoma e assicurano la replicazione corretta. Infatti nell’uomo i telomeri si accorciano di un certo numero di nucleotidi, e è fondamentale per proteggere il genoma codificante dell’uomo. I telomeri anche loro sono fatte da unità ripetute tante volte, unità base e specie specifica e nell’uomo si ha TTAGGG. Non ci sono 171 pb come nel centromero, ma ci sono solo queste 6 basi che sono alla fine del braccio corto e lungo. I telomeri permettono alla cellula di distinguere la vera fine del cromosoma da una rottura. Il DNA telomerico quindi si compone di tante copie di TTAGGG. Viene sintetizzato dalla telomerasi. TTAGGG non codifica per nulla e è determinante però onde evitare la perdita di informazione durante la duplicazione cromosomica. Se non ci fossero infatti i telomeri che si accorciano al posto del genoma codificante, la replicazione del DNA ogni volta comporterebbe perdita di DNA. Le telomerasi sono potentemente attive nelle cellule germinali, ma spente del tutto nelle cellule dell’adulto differenziate. Quindi la lunghezza del telomero è proporzionale al numero di cicli di replicazione avvenuti. Il telomero però ha un’altra funziona, stabilizza infatti le estremità dei cromosomi. Perché c’è il bisogno? Di fatto il cromosoma è una struttura lineare, se non ci fossero i telomeri di fatto i cromosomi andrebbero incontro a strutture appiccicose, formando strutture non consone con altri cromosomi. I telomeri allora impediscono ai macchinari di riparo del DNA di riconoscere le estremità del cromosoma come rottura del cromosoma stesso e quindi una riparazione completamente sbagliata. Quindi, ipotizzando la perdita del telomero, non si perderebbe niente di importante dall’aspetto codificante, ma verrebbe segnalata la fine del cromosoma come una delezione che sarebbe riparata come un ricombinazione con un altro cromosoma. Tra le mutazioni cromosomiche troviamo due gruppi, di struttura e numero, e tra le mutazioni a struttura parliamo di un cromosoma ad anello che altro non è che un cromosoma che perde entrambe le estremità telomeriche.

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Nascita della citogenetica

La citogenetica nasce a metà del XX secolo con Tijo e Levan che per primi riuscirono a colorare i cromosomi. Il colorante è il Geimsa. La tecnica messa a punto e il cariotipo fatto, permette l’accertamento del numero di cromosomi. Questo perché queste strutture si colorano tutte in modo uniforme e non posso veder alterazioni di forma, ma solo di numero. I primi cariotipi infatti vennero fatti considerando solo due cose, numero e posizione del centromero.

Negli anni ‘70 nasce la citogenetica classica con l’introduzione delle tecniche di bandeggio che danno al possibilità di identificare singoli cromosomi con il caratteristico pattern di bandeggio, ovvero alternanza di bande chiaro-scure caratteristiche per ogni cromosoma. Si ha per alterazioni che coinvolgono almeno 5 megabasi. Le tecn