Genetica (malattie genetiche, cromosomi e ciclo cellulare, test genetici, analisi DNA, test prenatali)

Genetica

Genoma e codice genetico

• Genoma e codice genetico pag. 2; vedi PDF.
• Ciclo cellulare (mitosi e meiosi) → pag. 4-6.
• Cromosomi + colture cellulari pag. 6-7.
• Classificazione malattie genetiche pag. 8.
• 1. Cromosomiche pag. 8.
• Numero: Down, Edwards, Patau pag. 9-10.
• Cromosomi sex. X: Turner, Klinefelter pag. 10.
• Struttura: Cri du Chat, Hirschhorn pag. 11.
• 2. Monogeniche pag. 12.
• 3. Mendel + patologie mendeliane pag. 13-15.
• Autosomiche dominanti (Marfan, ipercolesterolemia) pag. 16-17.
• Autosomiche recessive (fibrosi cistica, malattie legate all’X) pag. 18.
• X-linked recessive (distrofie muscolari) pag. 20.
• Ereditarietà non mendeliana pag. 23.
• Sindrome dell’X fragile.
• 4. Mitocondriali pag. 24.
• 5. Poligeniche pag. 24-25.
• Analisi del DNA + albero genealogico pag. 27.
• Test genetici + tumori ereditari (mammella) pag. 28-31.
• Diagnosi prenatali: invasivi e non pag. 32-34.

Pag. 1

Proteoma: complesso delle proteine espresse dal genoma in un organismo;

Epigenoma: insieme dei fenomeni che modificano il DNA senza intaccare la sequenza ma regolando l’espressione;

Metaboloma: insieme dei prodotti dei processi metabolici in un organismo.

Quindi con il termine epigenetica si indicano quelle modificazioni del DNA e della cromatina che influenzano il genoma e l’espressione genica senza alterare il DNA.

Differenze tra mutazione genetica e modificazione epigenetica

Nella mutazione genetica si inserisce una base di DNA all’interno della sequenza del DNA ed è chiaro che c’è uno slittamento della lettura delle triplette e quindi abbiamo una perdita o un’alterazione di funzionalità proteica (proteina che si dovrà formare) o perdita o alterazione dell’espressione; questo è un meccanismo irreversibile, una volta avvenuta la modificazione non è più reversibile.

Nella modificazione epigenetica la sequenza resta identica però interviene il fattore esterno ad agire su qualche base di DNA alterandone l’espressione, questo meccanismo è reversibile, cioè eliminando il fattore che interviene e che modifica questa alterazione può tornare alla normalità.

Prevalenza cioè la percentuale di persone che in un dato momento, in una determinata popolazione, presentano una certa patologia, quindi la prevalenza è come se fosse una fotografia sulla situazione presente per quella patologia in una determinata popolazione.

Incidenza è percentuale con la quale si verificano nuovi casi, per esempio se diciamo 1 su 1000 nati vuol dire un nuovo caso ogni mille nati.

Il genoma

Il genoma è l’intero patrimonio genetico di un organismo vivente; si può paragonare ad un’enorme enciclopedia in cui sono contenute le istruzioni che regolano lo sviluppo e il funzionamento dell’organismo. Il genoma è scritto in un composto chimico chiamato DNA (acido desossiribonucleico).

Il codice genetico

Il codice genetico può essere definito come la sequenza di nucleotidi del DNA che, a tre a tre, codifica per un aminoacido nella proteina da sintetizzare.

Pag. 2

Ogni tripletta di nucleotidi, detta codone, specifica un solo aminoacido mentre ogni aminoacido può essere codificato da più triplette.

Poiché ci sono 4 nucleotidi, le possibili triplette o codoni che si possono ottenere sono 4³=64. Però ci sono 20 aminoacidi che vengono a costituire le proteine che si trovano in natura, ne risulta che uno stesso aminoacido può essere codificato da più triplette; si dice così che il codice è degenerato. Di queste 64 triplette possibili, 61 corrispondono ai 20 aminoacidi, 3 sono dette no senso perché non specificano alcun aminoacido, esso sono: UAG, UGA, UAA. (Se volessimo scrivere tutto il genoma su un foglio di carta avremo bisogno di cinquecentocinquantamila pagine).

Il DNA è avvolto in 46 piccole strutture filiformi visibili al microscopio che sono i cromosomi. I cromosomi sono 46 in un individuo normale; sui cromosomi sono distribuiti circa 30 mila geni ai quali è affidata l’informazione ereditaria elementare. Ogni gene, infatti, è un pezzo di DNA di lunghezza molto variabile che contiene l'informazione genetica per costruire una determinata proteina.

Essi rappresentano solo il 10% circa di tutto il DNA di una cellula; il restante 90% considerato fino a pochi anni fa “DNA spazzatura”, perché non sembrava avere alcuna funzione, ha in realtà un ruolo importantissimo nella regolazione dell’espressione genica.

Nella struttura di un gene eucariotico abbiamo due pezzi importanti: esoni segmenti di un gene rappresentati nell’ mRNA maturo, costituiscono le parti funzionali del gene che verranno tradotte nella sequenza aminoacidica e introni sequenze di DNA non codificanti che si alternano agli esoni; il numero e la dimensione degli introni varia nei differenti geni.

Il dogma centrale della biologia molecolare comprende la trascrizione dove l’informazione genetica viene trasmessa dal DNA dei cromosomi al RNA messaggero; lo splicing con la rimozione degli introni e la fusione degli esoni nel RNA durante la trascrizione e infine la traduzione dove l’informazione genetica viene tradotto dal RNA messaggero in proteina. Chiaramente la proteina poi si ripiega su se stessa nella struttura tridimensionale per poi essere funzionale. Quindi il flusso dell’informazione genetica avviene in una sola direzione, DNA – trascrizione – RNA messaggero – traduzione – proteine.

In generale se il DNA si potesse srotolare, ogni cellula ne conterrebbe più di un metro, ma allo stesso tempo la doppia elica è così sottile ed avvolta su se stessa da occupare un volume microscopico.

Con tutto il DNA presente nel nostro organismo si potrebbe coprire 1200 volte la distanza fra la terra e il sole.

Chiaramente il DNA per poter stare, in queste ridotte dimensioni, all’interno del nucleo della cellula devono essere utilizzate delle strutture proteiche attorno alle quali si compatta; queste strutture proteiche sono istoni e proteine non istoniche.

I nucleosomi sono formati da un ottamero di istoni e su ognuno di essi si avvolge un filamento di DNA contenete 200 paia di basi. Essi poi si condensano ulteriormente in nucleo filamenti che si associano in anse su una struttura polisaccaridica. Quindi prima della duplicazione ogni cromosoma è costituito da una singola molecola di DNA. Dopo la duplicazione un cromosoma appare costituito da due cromatidi fratelli che contengono ciascuno una copia della molecola di DNA. Durante la mitosi della divisione cellulare i cromatidi fratelli si dividono e vengono ripartiti fra le cellule figlie, quindi ogni cellula figlia ha il patrimonio genetico identico.

Pag. 3

Il ciclo cellulare

Corrisponde al periodo di vita della cellula e bisogna tener conto che la replicazione del DNA avviene solo durante una specifica fase della vita della cellula. Nel ciclo cellulare quindi abbiamo varie fasi: la G0 nella quale la cellula non si riproduce, G1 in cui abbiamo la crescita e la riproduzione degli organuli, S in cui abbiamo replicazione del DNA, G2 in cui abbiamo la sintesi proteica e M dove avviene la mitosi cioè la divisione cellulare; i tempi coincidono intorno alle 24 ore.

La divisione cellulare è un processo che da origine a nuove cellule, avviene durante lo sviluppo embrionale, nella formazione dell’organismo adulto e nella vita adulta, dove circa 25 milioni di cellule al secondo sono soggette a divisione.

Il ciclo cellulare ha vari checkpoint, dove nel checkpoint in G1 la cellula verifica la dimensione e l’integrità del DNA, nel checkpoint in G2 la cellula verifica la sintesi e i danni del DNA, nel checkpoint in M la cellula verifica la formazione del fuso e l’attacco di cinetocori e dopo di questo c’è la decisione di uscire dal ciclo cellulare oppure rientrare nel ciclo.

Mitosi

È un processo cellulare mediante in quale è assicurata la precisa distribuzione di copie esatte del materiale genetico a due cellule figlie che risultano geneticamente identiche tra loro e rispetto alla cellula madre. Le fasi della mitosi sono: interfase, profase, metafase, anafase e telofase.

Profase: i filamenti di cromatina, spiralizzandosi e ripiegandosi, si accorciano progressivamente diventando visibili microscopicamente. Ogni cromosoma è costituito da due cromatidi identici uniti all’altezza del centromero, contemporaneamente si organizza l’apparato mitotico alla fine della profase nella fase detta prometafase scompare l’involucro nucleare.

Metafase: i cromosomi si dispongono sul piano equatoriale della cellula, formando la piastra equatoriale.

Pag. 4

Anafase: i due cromatidi fratelli di ciascun cromosoma si separano migrando verso i poli; la separazione dei due cromatidi avviene in modo improvviso e sincrono in tutti i cromosomi questo per evitare il fenomeno della non disgiunzione cioè della possibilità che per un certo cromosoma non si stacchino i cromatidi dal centromero e quindi entrambi i cromatidi vanno su una cellula e sull’altra cellula non va nessun cromatide, quindi nessuna parte di DNA di quel cromosoma. E avremo in questo caso una cellula con un cromosoma in più e una cellula con un cromosoma in meno.

Telofase: processi che procedono in senso “inverso” a quelli della profase, c’è una despiralizzazione e dispiegamento dei cromosomi e la formazione dell’involucro nucleare e segue la citodieresi.

Citodieresi: comparsa del solco equatoriale che si restringe progressivamente finché la cellula si divide in due cellule figlie e i componenti citoplasmatici vengono distribuiti più o meno ugualmente nelle due cellule figlie.

Per la riproduzione abbiamo un meccanismo di meiosi che porta alla formazione dalle cellule somatiche alle cellule germinali, cellule uovo nelle donne e spermatozoi negli uomini.

I gameti posseggono un corredo cromosomico dimezzato, perciò sono cellule aploidi. Dalla fusione di due cellule aploidi, per fecondazione, si ottiene un organismo diploide. Successivamente, un discendente di questa cellula diploide si divide producendo nuove cellule aploidi e così via con un processo detto di meiosi. Infatti, la riproduzione sessuata comprende due eventi fondamentali: la meiosi e la fecondazione. Il ciclo della vita sessuata comporta quindi l’alternanza fra generazioni di cellule aploidi e cellule diploidi. Quindi la cellula somatica si divide per meiosi e forma cellule aploidi, queste si uniscono insieme alla fecondazione e otteniamo una cellula diploide.

La riproduzione sessuata ha il grande vantaggio dell’evoluzione della specie perché aumenta la variabilità genetica con i seguenti meccanismi: assortimento indipendente dei cromosomi omologhi nella I divisione meiotica e ricombinazione o crossing-over tra cromosomi omologhi (che avviene solo nella profase della I divisione meiotica) e infine la casualità della fecondazione di una cellula uovo da parte di uno spermatozoo.

L'allineamento all'equatore dei due omologhi é casuale per cui é casuale quale dei due cromosomi vada verso un polo o verso l'altro provocando, come conseguenza, l'assortimento indipendente delle caratteristiche genetiche portate sui diversi cromosomi. Il numero delle combinazioni possibili é uguale a 2 elevato alla potenza del numero di paia di cromosomi. Se ad es. si allineano tre paia di cromosomi (cellula ipotetica) si possono ottenere 2³=8 gameti differenti.

Nell’uomo abbiamo la segregazione indipendente di 23 paia di cromosomi si possono ottenere 2²³=8 milioni di gameti; alla fecondazione: 8 milioni x 8 milioni = 64 trilioni di combinazioni zigotiche; aggiungendovi anche il crossing-over le possibilità sono illimitate.

Questi dati indicano che la meiosi è un meccanismo biologico in grado di garantire l’unicità biologica delle persone. L’unica eccezione è rappresentata dai gemelli monozigoti.

Nella meiosi e gametogenesi maschile e femminile: alla fine della meiosi maschile abbiamo 4 spermatozoi maturi e alla fine della meiosi femminile abbiamo 1 ovocita e 3 globuli polari. Sono tante le fasi della meiosi, inoltre si divide in meiosi I e meiosi II. I cromosomi omologhi vengono duplicati e si presentano come cromatidi fratelli uniti, per cui per produrre i gameti aploidi occorrono 2 divisioni nucleari.

Pag. 5

Da ogni cellula diploide si ottengono 2 cellule figlie diploidi nella prima divisione meiotica e da ognuna di queste si ottengono 2 cellule aploidi dalla seconda divisione meiotica.

Nella profase meiotica le due copie di ciascun cromosoma detti cromosomi omologhi si appaiano e si scambiano materiale genetico con la ricombinazione o crossing-over.

Il chiasma non è altro che la formazione di uno scambio a filamenti incrociati tra due eliche di DNA omologhe di cromatidi non fratelli. Quindi nel chiasma abbiamo le due eliche di DNA omologhe, vediamo un incisione del filamento dove avviene lo scambio e la saldatura dei filamenti incisi, quindi abbiamo due molecole di DNA congiunte dal chiasma.

Nell’uomo ogni coppia di cromosomi subisce mediamente 2, 3 eventi di ricombinazione. I chiasmi sono appunto i siti di ricombinazione che sono visibili al microscopio ottico.

Per effetto del crossing-over le 4 cellule risultanti dalla meiosi avranno 4 cromatidi diversi, quindi partendo da un cromosoma materno e paterno, avviene il crossing-over fra i cromosomi e alla fine della divisione avremo 4 cellule risultanti con cromatidi diversi dalle cellule d’origine.

A differenza della mitosi dove la divisione porta alla formazione di due cellule diploidi, ogni cellula diploide che va in meiosi produce quattro cellule aploidi.

Le principali differenze tra la mitosi e meiosi: mitosi avviene nelle cellule somatiche, abbiamo una divisione cellulare, non c’è un appaiamento dei cromosomi omologhi e non c’è ricombinazione; mentre la meiosi avviene nelle cellule germinali, abbiamo due divisioni cellulari, c’è un appaiamento dei cromosomi omologhi e c’è una ricombinazione.

Abbiamo inoltre delle conseguenze genetiche dovute alla meiosi:

• Assortimento indipendente dei cromosomi omologhi: un gamete contiene cromosomi ereditati sia per via paterna che materna.
• Segregazione degli alleli: un gamete contiene una singola copia di un gene.
• Ricombinazione: porta a ogni cromosoma contenuto nei gameti contiene materiale sia di origine materna che di origine paterna.

I cromosomi

Sono strutture portatrici dell’informazione genetica, sono 46 per ogni individuo normale, sui 46 cromosomi sono distribuiti circa trentamila geni. La branca della genetica che si occupa dei cromosomi prende il nome di citogenetica, si occupa delle tecniche per lo studio dei cromosomi, delle malattie cromosomiche in particolare la parte relativa all’alterazione genetica e meno a quella relativa alle variabili cliniche fenotipiche del soggetto, e poi tumori in cui abbiamo anomalie cromosomiche molto caratteristiche nelle cellule somatiche.

I cromosomi sono visibili soltanto nelle cellule in attiva divisione; fino al 1970 la classificazione dei cromosomi si basava esclusivamente sulla dimensione e sulla posizione del centromero; e l’avvento di tecniche particolari di bandeggio ha consentito una classificazione e uno studio accurato che consente di visualizzare anche piccoli riarrangiamenti dei cromosomi.

Pag. 6

Se vogliamo ottenere questi cromosomi abbiamo necessità di fare una coltura cellulare, cioè coltivare queste cellule, in quanto abbiamo detto che i cromosomi si possono estrarre solo da cellule in attiva divisione.

I principi base delle colture cellulari devono essere allestite osservando una completa asepsi (tutti i passaggi devono avvenire in completa sterilità), vengono utilizzati terreni di coltura che contengono sali, glucosio, aminoacidi essenziali, rosso fenolovitamine, nucleotidi e, in genere, un indicatore il che serve a stabilire che il terreno ha un pH idoneo a far moltiplicare queste cellule. Fino ad alcuni anni fa i terreni di coltura si preparavano in laboratorio aggiungendo sul terreno di base tutte queste sostanze, adesso invece esistono terreni già pronti all’uso. L’ambiente di lavoro attualmente avviene sotto la cappa a flusso laminare cioè una cappa con un filtro epa (che ha la possibilità di filtrare sia batteri che virus) e l’aria che viene cacciata nella cappa rimane in circolo cioè l’aria sterile arriva all’interno della cappa, risale, viene filtrata e ritorna sterile.

Quindi all’interno della cappa abbiamo sempre un’aria sterile che permette di lavorare in maniera adeguata in completa asepsi. La cappa è fornita di lampada ad ultravioletti da utilizzare per la sterilizzazione notturna dell’ambiente di lavoro e tutti i piani di lavoro vanno puliti periodicamente con soluzioni antisettiche. Nell’ambiente di lavoro devono essere utilizzati: guanti sterili, cautela nella manipolazione di cellule e terreni, cambio frequente di pipette e uso di pipettatori automatici.

I tessuti e le cellule utilizzate per la citogenetica sono tutti i tessuti e cellule che hanno nucleo, quindi i linfociti da sangue periferico, cellule del midollo osseo, cellule da trofoblasto, cellule da fibroblasti o amniociti e cellule di tessuto tumorale. Solo per i linfociti che non sono in divisione spontanea è necessario utilizzare una sostanza che deve stimolare le cellule alla divisione, questa sostanza si chiama fitoemoagglutinina, sostanza che si estrae dai fagioli rossi, ed è appunto una sostanza che stimola i linfociti alla divisione.

Citogenetica standard dove viene utilizzata per il sangue periferico, il prelievo avviene con provette a tappo verde che contengono all’intero eparina, quindi deve essere un prelievo eparinato; all&rsquo