Genetica ed epigenetica

Meccanismi epigenetici della regolazione del genoma

Nelle cellule eucariotiche la molecola di DNA è strutturata in cromatina, per contenere grandi quantità di DNA in un piccolo spazio e per consentire la regolazione del genoma stesso mediante meccanismi che alterino la struttura della cromatina stessa.

La cromatina è costituita da DNA associato a proteine istoniche che interagiscono in maniera elettrostatica con il DNA. La massima condensazione della cromatina la si osserva in mitosi (distinzione centromero e telomeri del cromosoma).

L’unità di base della cromatina è il nucleosoma: 2 istoni H2A, 2 istoni H2B, 2 istoni H3 e 2 istoni H4, per un totale di 146 bp associate all’ottamero istonico.

Gli istoni

• Sono proteine basiche con aa a carica positiva per l’interazione elettrostatica con il DNA carico negativamente.
• Le code N-terminali degli istoni sono maggiormente arricchite in aa basici soggette a modificazioni post-traduzionali che possono alterarne la carica positiva.
• Modificazioni istoniche consentono di alterare la struttura della cromatina passando da stati maggiormente aperti, accessibili a fattori di trascrizione e proteine che possono regolare il metabolismo del DNA, a strutture maggiormente compatte e quindi inaccessibili a proteine che regolano il metabolismo.

Il termine epigenetica deriva dalla fusione delle parole epi, che in greco significa sopra, e della parola genetica, e definisce come i tratti ereditabili del genoma non siano solo codificati dalla sequenza del DNA, ma siano anche depositati in fattori che sono posizionati sopra la sequenza di DNA. (1942 Waddington definì il termine epigenetica)

Informazione epigenetica

L’informazione epigenetica è coinvolta:

• Nel modulare in maniera differenziale il pattern di espressione genica, molto importante durante il differenziamento di lineage specifici cellulari.
• Nel propagare essenziali strutture architettoniche, come nei centromeri e nei telomeri.

La definizione più accettata è che l’epigenetica è lo studio dei cambiamenti ereditabili della funzione del genoma che avvengono senza che vi siano alterazioni della sequenza del DNA e quindi essa è in grado di registrare, segnalare e trasmettere attività e stati alterati della cromatina anche in seguito a condizioni ambientali sia interne che esterne.

Meccanismi epigenetici del DNA

I meccanismi epigenetici del DNA sono:

• Rimodellamento della cromatina, che può consentire o meno l’accesso a fattori di trascrizione in grado di legare sequenze bersaglio presenti nel DNA.
• Modificazioni istoniche che hanno un ruolo dinamico per consentire il passaggio da eucromatina ad eterocromatina e viceversa.
• Varianti istoniche che possono essere sostituite a varianti canoniche ed alterare la struttura della cromatina.
• Sequenze di RNA regolative non codificanti che possono essere coinvolte nel reclutamento di altri fattori che rimodellano la cromatina.
• Strutture 3D della cromatina tra cui i territori nucleari.
• Metilazione del DNA che è connessa al silenziamento genico.

Nonostante l’epigenetica non sia codificata nella sequenza di DNA stesso, i marcatori epigenetici sono ereditabili, quindi il termine genetica rappresenta bene questo concetto all’interno della parola epigenetica.

Tuttavia ha un grado di plasticità e reversibilità, diversamente dalla genetica che è codificata nella sequenza di basi ed è stabile.

Stati della cromatina

Lo stato della cromatina è osservabile attraverso microscopi elettronici:

• Eterocromatina: stati maggiormente condensati, DNA relativamente compatto, non trascritto perché non accessibile ai fattori di trascrizione.
• Eucromatina: zone più rilassate, meno dense per gli elettroni della microscopia elettronica, DNA relativamente aperto, accessibile ai fattori di trascrizione e quindi trascrivibile.

La cromatina è composta da diversi domini, caratterizzati da particolari stati:

• Nell’arricchimento delle modificazioni post-traduzionali.
• Nelle varianti istoniche.
• Nella metilazione del DNA.
• Nello stato di occupazione dei nucleosomi sulla cromatina stessa.
• Nei territori nucleari.

Le modificazioni post-traduzionali avvengono sulle code N-term degli aa basici (lisine, arginine, serine, proline) degli istoni ed ognuna ha un ruolo diverso.

La scelta delle modificazioni post-traduzionali è molto importante perché possono cambiare la proprietà funzionale dell’aa ed avere un ruolo sulla struttura cromatinica e quindi sulla trascrizione.

Modificazioni identificate

Modificazioni ad oggi identificate:

• Acetilazione: iston-acetiltransferasi (HAT).
• Deacetilazione: iston-deacetilasi.
• Metilazione sulle lisine e sulle arginine: lys/arg metilasi.
• Fosforilazione: chinasi.
• Ubiquitilazione: ubiquitilasi.
• Sumoilazione.
• ADP-ribosilazione.
• Deaminazione.
• Isomerizzazione delle proline.

I ruoli principali di queste modificazioni si hanno nella trascrizione, replicazione, riparo del DNA o condensazione della cromatina.

• Istone H2AZ: principalmente a livello del promotore, livelli di trascrizione bassi.
• Acetilazione istoni H3 e H4: apre la cromatina, soprattutto a livello dei promotori, livelli di trascrizione alti.
• Metilazione: lungo tutto il corpo del gene, posti in regioni di regolazione o su tutto il corpo del gene; a seconda del livello di metilazione, anche di uno stesso residuo (H3 metilato in K4, mono/di/tri metilato) si avranno diversi livelli di trascrizione.

In conclusione, la cromatina è uno stato molto dinamico, che può essere altamente condensato o aperto; l’apertura della cromatina necessita di modificazioni post-traduzionali sugli istoni:

• Regioni trascrizionalmente aperte sono quelle con istoni fortemente acetilati e dove viene rilasciato l’istone H1, importante per condensare i nucleosomi tra di loro.
• Regioni trascrizionalmente chiuse, che formano il solenoide, sono regioni meno accessibili ai fattori di trascrizione perché gli istoni sono più condensati al DNA grazie a una riduzione dei livelli di acetilazione sugli istoni del nucleosoma e grazie al reclutamento di alti livelli dell’istone H1.

Modificazioni istoniche

L’eucromatina è una struttura più rilassata che permette ai fattori di trascrizione di accedere alle sequenze target ed attivare la trascrizione stessa. Acetilazione degli istoni.

Nell’eterocromatina le code N-terminali sono fortemente deacetilate, ma è possibile osservare metilazione degli istoni e del DNA soprattutto nelle regioni definite isole CpG.

Esiste un forte equilibrio tra acetilazione e deacetilazione che consente di mantenere lo stato cromatinico correttamente regolato per la regolazione dell’espressione genica.

HATs e HDACs

Le HATs sono suddivise in due famiglie:

• Tipo A: localizzazione nucleare, acetilano gli istoni condensati nel nucleosoma, in reazioni strettamente associate all’attività trascrizionale.
• Tipo B: localizzazione citoplasmatica, acetilano gli istoni che sono stati appena sintetizzati, prima che questi vengano incorporati durante la replicazione del DNA. Marcatori tipici degli istoni appena sintetizzati sono acetilazione K4 e K12 dell’H4.

Le HDACs sono suddivise in diverse classi:

• Classi I, II, IV comunemente chiamate solo HDACs.
• Classe III, costituita da enzimi NAD-dipendenti, chiamate sirtuine.

Le HDACs hanno una bassa specificità per il substrato, quindi un singolo enzima è in grado di deacetilare diversi siti nello stesso istone. La specificità può essere attribuita nel complesso di HDACs da altre proteine.

Per quanto riguarda l’acetilazione delle lisine, target delle HATs, possono creare una piattaforma di aggancio per altre proteine, ad esempio riconoscono lisine acetilate i bromodomini.

È possibile ottenere una cascata di eventi dove la modificazione delle HATs sulle lisine crea un segnale per il reclutamento di proteine con un bromodominio che molto spesso sono HATs stesse, che quindi riescono successivamente ad apportare modifiche sugli istoni fiancheggianti. Ad esempio dominio PHD fingers.

Metilazione degli istoni

La metilazione degli istoni può avvenire sia sulle lisine che sulle arginine; gli enzimi in questione vengono chiamati iston-metiltransferasi (KMTs: lisina, PRMTs: arginina).

• Metilazione delle lisine: avviene attraverso step successivi, dapprima la mono, poi la di e la tri metilazione. Gli effetti sulla cromatina sono diversi a seconda del residuo metilato.
  • K9, K27 su istone H3: silenziamento genico e formazione di eterocromatina.
  • K4, K79, K36 su istone H3: apertura della cromatina.

Metilazione delle arginine: avviene prima attraverso una monometilazione e successivamente può seguire una dimetilazione che può essere simmetrica o asimmetrica. I siti tipicamente modificati sono costituiti dalle sequenze RGG o RXR (R = arginina, G = glicina, X = qualunque aa). Gli enzimi coinvolti sono PRMT1 e PRMT5; nei modelli murini KO si è osservato che la perdita di funzione di entrambi i geni non è compatibile con la vita.

Il ruolo delle metiltransferasi su arginina è importante non solo per la regolazione della trascrizione genica, essendo ubiquitariamente espresse, controllano anche la crescita cellulare, la proliferazione, il differenziamento.

La metilazione degli istoni è in grado di reclutare proteine che contengono dei Tudor domains; proteine che svolgono ruolo fondamentale nella trascrizione genica.

Cross-talk delle modificazioni istoniche

Esiste una interazione tra le modificazioni istoniche chiamata cross-talk che può essere di diverso tipo:

• Antagonismo competitivo, in cui lo stesso residuo di un istone può essere differenzialmente modificato:
  • Acetilazione: apertura della cromatina.
  • Metilazione: chiusura della cromatina.
• Il legame di una proteina ad una particolare modificazione può andare ad alterare modificazioni adiacenti.
• L’attività di un enzima può andare ad alterare la modificazione di un substrato.

Ci può essere cooperazione tra le varie modificazioni:

• La metilazione della lisina K4 dell’istone H3, che correla con un significato positivo e quindi di apertura della cromatina, è in grado di attivare la successiva acetilazione non solo delle lisine presenti nell’istone H3 stesso, ma anche nelle lisine dell’istone H4.
• La metilazione in lisina K9, che ha un significato di chiusura della cromatina, va ad inibire l’acetilazione sia su H3 che su H4 attivando invece la deacetilazione.
• La fosforilazione in serina 10 dell’istone H3 attiva successivamente l’acetilazione delle lisine presenti sullo stesso istone.

La teoria del codice istonico definisce che le modificazioni post-traduzionali possano creare dei siti di aggancio per il reclutamento di altri fattori che rimodellano la cromatina.

• Qui ad esempio è indicato come i residui acetilati degli istoni possano reclutare proteine contenenti dei bromodomains, che spesso sono esse stesse iston-acetiltransferasi (HAT) in grado di attivare una serie di eventi a cascata che consentono l’acetilazione dei vari istoni uno in seguito all’altro.
• Per quanto riguarda l’eterocromatina è stato possibile osservare che la metilazione degli istoni è in grado di richiamare proteine contenenti dei chromodomains, e questo è spesso correlato a proteine che possono esse stesse metilare gli istoni o reclutare iston-metiltransferasi.

Proteine che agiscono sulla cromatina

Possiamo distinguere diverse categorie di proteine che agiscono sulla cromatina:

• Writers, proteine in grado di apporre le modificazioni post-traduzionali, come HATs, HMTs, PRMTs e chinasi.
• Readers contengono quei domini che possono essere reclutati tramite le modificazioni post-traduzionali, bromodomains, chromodomains, PHD-fingers domains. Queste proteine che “leggono” sono in grado di comunicare il segnale di trascrizione aperta o chiusa.
• Erasers, proteine come HDACs, KDMs, fosfatasi che catalizzano la rimozione della modificazione.

Il codice istonico interagisce con numerosi altri meccanismi epigenetici, come la metilazione del DNA, la deposizione di nuove varianti istoniche, l’organizzazione nucleare, gli RNA non codificanti e i rimodellatori della cromatina, per ottenere un risultato univoco a livello trascrizionale.

Varianti istoniche

Per gli istoni H4 e H2B esiste solo la forma canonica mentre per H2A esistono 3 varianti definite con H2AX, H2AZ, macroH2A e per H3 altre due: H3.3 e CENP-A.

Tali varianti conferiscono funzioni diverse alla cromatina:

• H2AZ provoca instabilità genomica.
• H2AX attiva meccanismi di riparo del DNA.
• MacroH2A è associato all’inattivazione del cromosoma X.
• H3.3 è associato a zone trascrizionalmente attive.
• CENP-A è associato ai centromeri (è la variante centromerica del canonico istone H3).

Istone H3

L’istone H3 ha due varianti canoniche che sono H3.1 e H3.2 diffuse durante la replicazione (fase S), quindi sono istoni assemblati durante la replicazione del DNA. H3.3 invece viene assemblato fuori dalla fase S cioè c’è un picco di espressione non correlata alla fase di replicazione.

La sequenza proteica di H3.1 rispetto ad H3.3 varia di 4 aminoacidi che possono subire modificazioni post-traduzionali molto diverse.

I marcatori maggiormente presenti sono di trimetilazione di lys4, acetilazione lys9, 18 e 23 e metilazione in lisina K79.

Avendo significato funzionale completamente diverso H3.3 non può essere incorporato in un nucleosoma in cui troviamo H3.1. C’è un picco di espressione di H3.3 nel differenziamento cellulare perché non c’è replicazione.

CENP-A

È la variante centromerica, si trova solo nei centromeri.

Se overespresso, può diffondersi lungo il cromosoma.

Nonostante non sia ancora chiara la funzione di CENP-A, i meccanismi alla base del reclutamento ci fanno capire che è la struttura della cromatina che consente a CENP-A di essere integrato.

È fondamentale per la corretta segregazione: CENP-A ha un picco in fase G2 dopo la replicazione del DNA e prima che avvenga la divisione mitotica per consentire una corretta segregazione dei cromosomi. (Le mutazioni omozigote nei topi KO per CENP-A danno la mortalità nel topo).

I nucleosomi che hanno H3.3 sono molto meno stabili rispetto a quelli che hanno H3.1 e ciò è importante perché durante la trascrizione i nucleosomi devono essere maggiormente dinamici e devono essere rilasciati dalla cromatina per consentire l’accesso ai fattori di trascrizione.

• H3.3 non viene ereditato perché durante la replicazione sono ereditati solo H3.1 e H3.2. Quindi partendo da una regione trascrizionalmente attiva dove c’è H3.3 con le sue modificazioni post-traduzionali, dopo la replicazione H3.3 viene sostituito da H3.1 così non preserviamo l’info che quel gene deve essere trascritto ma succede che ad opera di chaperonine (es. HIRA) l’istone H3.1 viene sostituito da H3.3 e gli istoni H3.3, già assemblati con le modificazioni post-traduzionali, comunicano l’informazione epigenetica agli istoni H3.3 neoassemblati.

La modificazione post-traduzionale già presente riesce a reclutare proteine che modificano l’istone fiancheggiante appena incorporato che trasmette l’informazione epigenetica.

H2AZ

Viene sintetizzato lungo tutto il ciclo cellulare ed incorporato nella cromatina al di fuori della replicazione del DNA (fase S).

• Definisce quali sono le regioni di confine tra domini cromosomici con funzioni diverse.
• Nella corretta segregazione dei cromosomi.
• Nella replicazione.
• Nel riparo del DNA.
• Si trova spesso nelle regioni regolatrici di un gene, viene sostituito ad H2A soprattutto nel promotore.
• Nella regione codificante non è così tanto sostituito ad H2A.

Ha un picco nei promotori ed è correlato a silenziamento genico. KO morte durante gastrulazione.

Nelle cellule di mammifero è possibile vedere che non c’è una corretta segregazione dei cromosomi e c’è un’interruzione della distribuzione della proteina HP1alpha, specifica per l’eterocromatina.

Questo indica che, negli eucarioti superiori, H2AZ è coinvolto nel confinare HP1alpha in regioni specifiche e, quindi, nel mantenimento dell’eterocromatina.

H2AX

Possiede nella regione C-terminale una serie di aa tra cui la serina.

La serina 139 è l’unico aminoacido che può essere fosforilato su questo istone dopo danno al DNA a doppia elica grazie alla chinasi ATM.

La fosforilazione della serina 139, quindi di H2AX, porta ad una cascata di eventi che attiva una serie di proteine che attivano il riparo del DNA stesso.

MacroH2A

È formato da due domini: un istone che è simile al canonico H2A ed uno che non è omologo a nessuno degli istoni.

Questa variante è più grande dell’istone normale e viene assemblata nel cromosoma X inattivo. La sua incorporazione non inattiva il cromosoma X ma è fondamentale per il mantenimento dell’inattivazione dell’X.

Eterocromatina

L’eterocromatina si trova in regioni strutturali dei cromosomi come centromeri e telomeri ma anche in domini interdispersi, infatti stabilizza le sequenze di DNA altamente ripetute per evitare fenomeni di ricombinazione che avvengono tra regioni omologhe di DNA.

L’eterocromatina ha un ruolo nell’espressione genica, durante il differenziamento cellulare nello sviluppo.

Questo tipo di condensazione della cromatina viene ereditato stabilmente attraverso cicli di divisione cellulare.

In genere in quasi tutti gli organismi passando da una regione attiva trascrizionalmente si vede la metilazione in lisina K4 e acetilazione in lisina K9, queste modifiche devono esserci tutte.

Nell’eterocromatina c’è la mancanza di lisina K9: ciò consente attraverso il codice istonico di reclutare proteine che marcano esse stesse la cromatina.