Genetica dei microorganismi

Capitolo 9: La genetica dei microorganismi

I lieviti

I lieviti sono cellule eucariote che appartengono al regno dei funghi. Sono organismi che ricavano l'energia di cui hanno bisogno sotto forma di ATP mediante la respirazione aerobica (se si trovano in presenza di O₂) o mediante la fermentazione (in assenza di O₂). I lieviti Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pombe sono anche ampiamente utilizzati nei processi biotecnologici in quanto, con la fermentazione, convertono gli zuccheri in CO₂ necessaria, ad esempio, nella lievitazione del pane o dei dolci e in etanolo che è invece utilizzato nella produzione della birra e del vino.

Sono organismi unicellulari provvisti di una parete cellulare esterna piuttosto resistente, possono avere una forma ellittica o sferica. Per quanto riguarda le dimensioni, sono dell'ordine di pochi μm (micron) di diametro. La cellula di lievito essendo eucariote ha il proprio materiale genetico contenuto all'interno del nucleo mentre nel citoplasma sono presenti i vari organelli quali mitocondri, apparato di Golgi, ribosomi e così via. Quindi, nonostante sia un organismo eucariote unicellulare, mantiene la stessa struttura e organizzazione delle cellule eucariote pluricellulari (es. mammiferi).

Le cellule di lievito possono crescere sia in uno stadio aploide quindi con una sola copia di ciascun cromosoma, sia in uno stadio diploide quindi con due copie. In ogni caso, la proliferazione di tipo asessuale sia nella cellula diploide che in quella aploide avviene per mitosi. Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pombe si riproducono in maniera diversa secondo due modalità: il primo per gemmazione, il secondo per scissione.

Riproduzione per scissione e gemmazione

Nella riproduzione per scissione, al termine della mitosi, si ottengono due cellule figlie di identica dimensione che vengono separate tra di loro da una piastra cellulare che si forma dalle vescicole dell'apparato di Golgi. Queste dividono la cellula in due metà esattamente identiche. Normalmente, Saccharomyces pombe prolifera in uno stato aploide anche se, in condizioni ambientali sfavorevoli, due cellule aploidi si possono fondere tra di loro a formare una cellula diploide che immediatamente, per mitosi, produrrà cellule aploidi che sono dette spore. Quando le condizioni ambientali migliorano, le spore germinano in cellule aploidi che proliferano poi per mitosi.

Il ciclo cellulare dei lieviti, essendo eucarioti, passa attraverso le varie fasi G1, S, G2, M. La progressione da una fase all'altra è regolata da punti di check-point che sono fondamentali per verificare che tutti i componenti cellulari necessari nella fase successiva siano presenti. Prima di entrare in mitosi, la cellula nella fase S (in figura “start”) replica il proprio materiale genetico che, in Saccharomyces pombe, è suddiviso in 3 cromosomi nella fase aploide mentre nella fase diploide sono 6. Nella fase G2 del ciclo cellulare, la sintesi del DNA è terminata e la cellula si prepara ad entrare in mitosi. Il corpo polare del fuso (equivalente del centrosoma) si duplica e si associa alla membrana nucleare. I cromosomi duplicati nei due cromatidi fratelli, si condensano e dal corpo polare del fuso si organizzano le fibre del fuso mitotico.

Una caratteristica della divisione cellulare nel lievito è che la membrana nucleare non si dissolve e la separazione dei cromatidi fratelli, ad opera delle fibre del fuso, avviene all'interno del nucleo. Solo a seguito della separazione dei cromatidi fratelli, il nucleo si divide. Al termine della mitosi, avverrà anche la separazione del citoplasma con la formazione della piastra cellulare che dividerà la cellula in due metà uguali ciascuna con il proprio nucleo.

Saccharomyces cerevisiae si riproduce, invece, per gemmazione. È un processo nel quale la cellula madre sviluppa una piccola protuberanza esterna detta gemma. A partire dal punto di start, come in figura, quando la cellula è ancora in G1 inizia a formarsi la gemma che poi via via si accresce. Si duplica quindi il corpo polare del fuso e, nella fase S, il DNA viene replicato. Quando la cellula entra in G2, il nucleo si allunga e si posiziona tra la cellula madre e la gemma. La membrana nucleare, anche in questo caso, non si rompe e i cromatidi fratelli di ciascun cromosoma (che si sono formati durante la fase S) vengono separati all'interno del nucleo dai microtubuli che si sono generati dal corpo polare del fuso. A questo punto il nucleo si divide, siamo al termine della mitosi cioè nella citocinesi, la cellula madre e la gemma si separano. Quest'ultima in G1 si accresce fino a diventare grande come la cellula madre.

Saccharomyces cerevisiae: un organismo modello

Saccharomyces cerevisiae è un organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca biologica. Si può coltivare facilmente in laboratorio facendolo crescere su specifici terreni di coltura che contengono tutti i nutrienti necessari alla sua crescita. Questi terreni di coltura possono essere liquidi o solidi, come quello mostrato in figura (solido), in cui si vedono numerose colonie di lievito ciascuna formata da un insieme di cellule che si sono originate a partire da una singola cellula madre. Una cellula di lievito impiega circa 90 minuti per dividersi per cui in 24 ore se ne possono ottenere grandi quantità.

Il genoma di Saccharomyces cerevisiae è stato il primo genoma eucariote ad essere stato completamente sequenziato nel 1996. Nella sua forma aploide ha una dimensione di 12 x 10⁶ coppie di basi che sono distribuite su 16 cromosomi (più piccolo se paragonato con la dimensione di un genoma aploide umano che contiene 3200 x 10⁶ coppie di basi su 23 cromosomi). Si è stimato, inoltre, che l'intero genoma contiene circa 5800 geni funzionanti.

In figura, viene messa a confronto la densità genica di una regione di 80 kilobasi del genoma umano con quella del lievito. Le sequenze codificanti sono indicate con i rettangolini verdi. Nel lievito i geni sono molto ravvicinati tra di loro, lo spazio intergenico è molto limitato se confrontato con quello del genoma umano. Inoltre, la maggior parte dei geni nel lievito non contengono introni. Le sequenze ripetute, quali gli elementi trasponibili che nell'uomo occupano quasi il 45% del suo genoma, nel lievito sono molto più rare e occupano meno del 4% del genoma totale.

Le sequenze ripetute, nel lievito, appartengono alla classe dei retrotrasposoni virali o LTR che sono presenti anche in altre cellule eucariote e che, essendo retrotrasposoni, si mobilitano con un intermedio a RNA. Quelli di lievito sono indicati con Ty. Si tratta di sequenze nucleotidiche lunghe circa 6 kb caratterizzate dall'avere, nelle loro estremità, le sequenze LTR lunghe circa 340 coppie di basi e al centro una regione contenente i geni TyA e TyB che codificano per le proteine necessarie alla trasposizione. I geni TyA e TyB sono simili ai geni gag e pol dei retrovirus cioè di quei virus a RNA (come quello dell'HIV) che per replicarsi retrotrascrivono RNA in una doppia elica di DNA che va poi ad integrarsi nel genoma dell'ospite da dove può dirigere la produzione di nuove particelle virali che andranno ad infettare le cellule adiacenti. Il gene gag codifica per proteine strutturali del virus, il gene pol codifica per la trascrittasi inversa e l'integrasi e il gene env per proteine di membrane dell'involucro esterno virale. Negli elementi Ty del lievito è assente il gene env quindi non formano particelle virali infettive. Considerata la somiglianza dei retrotrasposoni come Ty con i retrovirus, si ritiene che la loro presenza nei genomi eucarioti siano relitti di ciò che è rimasto di passate infezioni virali.

Esistono 5 diverse famiglie di elementi Ty nel lievito quali Ty1, Ty2, Ty3, Ty4, Ty5 che si trovano in ceppi diversi di lievito. La famiglia Ty1 è quella più abbondante e anche quella meglio caratterizzata. In un genoma tipico di lievito ci sono circa 30 copie di questo elemento Ty1 integrate in punti diversi del genoma anche se non tutte sono attive per la retrotrasposizione. In figura è mostrata la modalità con cui queste sequenze possono retrotrasporre.

• L'elemento viene prima trascritto in RNA dall'RNA-polimerasi II del lievito a partire da un promotore che si trova nella sequenza LTR, a monte.
• Il trascritto passa poi nel citoplasma dove le sequenze gag e pol sono tradotte in proteine. Una di queste, la trascrittasi inversa, codificata dal gene TyB retrotrascrive l'RNA in un filamento di DNA complementare che viene poi convertito in doppia elica. Si è così generata una copia del retrotrasposone che, rientrando nel nucleo, va ad inserirsi in un punto diverso del genoma.

È grazie a questa specifica modalità di mobilizzazione che questi elementi vengono chiamati retrotrasposoni. Il lievito S.C può esistere e riprodursi nella sua forma aploide con 16 cromosomi o nella sua forma diploide con 32 cromosomi. In entrambe i casi la riproduzione di tipo asessuale avviene per mitosi con la cellula madre che produce per gemmazione una cellula figlia identica. Un altro dei vantaggi dell'utilizzo del lievito come sistema modello nella ricerca è proprio nella possibilità di poter studiare le caratteristiche di una cellula eucariote sia nella sua forma aploide che in quella diploide dal momento che, la propagazione e il cambiamento da aploide a diploide del lievito, è facilmente controllabile in laboratorio semplicemente variando i nutrienti aggiunti nel mezzo di coltura.

In figura è schematizzato il ciclo vitale del lievito S.C nella sua fase aploide e diploide. Le cellule aploide di S.C con 16 cromosomi sono di due tipi sessuali diversi: cellule a e cellule α.

• Nel passaggio 1, queste cellule aploidi di tipo sessuale opposto possono unirsi tra di loro nella riproduzione sessuale e formare una cellula diploide con 32 cromosomi.
• Le cellule diploidi, nel passaggio 2, possono proliferare dividendosi per mitosi. Se le condizioni ambientali in cui si trova il lievito variano (es. nutrienti scarseggiano), punto 3, allora la cellula di lievito (che si stava dividendo per mitosi) inizia il processo della meiosi. Al termine, vengono prodotte 4 cellule aploidi: 2 di sesso a e 2 di tipo α che sono i gameti dette, in questo caso, spore. Le 4 spore prodotte da ogni singola meiosi sono contenute all'interno di una struttura detta asco.
• Nel punto 4, quando le condizioni ambientali sono nuovamente favorevoli, l'asco si rompe rilasciando le spore aploidi che possono proliferare per gemmazione, dividendosi tramite mitosi. Queste cellule sessuali di tipo opposto possono eventualmente unirsi tra loro e il ciclo ricomincia.

Solo le cellule aploidi di tipo sessuale opposto possono fondersi per formare una cellula diploide. Le cellule a e quelle α differiscono tra di loro per la presenza di specifici recettori che sono presenti sulla superficie esterna detti recettori a e recettori α. Inoltre, differiscono per la secrezione di fattori proteici detti mating factor, anch’essi specifici di ciascuno dei due tipi sessuali. È proprio l’interazione tra questi recettori con i mating factor di tipi sessuali opposti che assicurano l’unione tra le cellula e quella α e impediscono l’unione di due cellule dello stesso tipo sessuale. A seguito dell’interazione, i mating factor agiscono bloccando il ciclo cellulare e andando ad attivare una serie di geni che sono coinvolti nel controllo della fusione cellulare e nucleare quindi nella formazione della cellula diploide a/α. Questa cellula diploide potrà proliferare dividendosi per mitosi o, in condizioni ambientali avverse, produrre per meiosi 4 spore aploidi (2 di tipo a e 2 di tipo α).

Differenti tipi cellulari di Saccharomyces cerevisiae

Quindi il lievito S.C può esistere in 3 differenti tipi cellulari:

• Cellule aploidi di tipo a
• Cellule aploidi di tipo α
• Cellule diploidi di tipo a/α

Questi 3 tipi cellulari differiscono tra di loro per caratteristiche fenotipiche, ad esempio, le due cellule aploidi sono morfologicamente identiche ma presentano recettori diversi e secernano diversi mating factor. Le cellule diploidi sono morfologicamente più grandi, non possono fondersi tra loro e non rispondono ai mating factor. È evidente quindi che, a queste caratteristiche fenotipiche diverse, deve corrispondere una diversa espressione genica considerando che il genoma (inteso come l’insieme dei geni) è identico nei 3 tipi cellulari (a parte il possedere un’unica copia di ciascun gene nelle cellule aploidi o due copie in quelle diploidi). Quindi ciò che varia nei tre tipi non è il contenuto genico bensì la diversa attivazione di determinati geni che conferiscono la specificità a ciascun tipo cellulare. Ad esempio, la cellula aploide α esprimerà gli stessi geni della cellula...