Genetica

Genetica

Genoma umano

Genoma umano: genoma cellulare (piccola porzione codificante) + genoma mitocondrio (maggiormente codificante).

Caratteristiche: (Mb megabase).

Piastra metafasica (solo durante la metafase è possibile osservare i cromosomi compatti): insieme dei cromosomi umani contenenti in una cellula, sono 46 cromosomi ed è stato possibile identificarli e numerarli tramite l’utilizzo della tecnica del bandeggio (n1 più grosso) e successivamente eseguito il sequenziamento grazie al quale è stato possibile quantizzare la quantità di DNA contenente in ciascun cromosoma (cromosoma n1 ne contiene di più e via a diminuire, eccezioni n9 ne contiene di meno del n10 e il n11 ne contiene di più).

Cromosomi sessuali definiti con lettere e non con i numeri ovvero XX femmine o XY maschi (cromosoma Y molto piccolo).

Telomeri: estremità del cromosoma.

Centromero: porzione centrale di unione.

I cromosomi nella maggior parte del loro ciclo cellulare non si trovano nella forma condensata presente durante la piastra metafasica.

Bandeggio

Cromatidi fratelli ovvero contengono copie identiche del DNA e stessa quantità di DNA, si formano durante la metafase in cui il DNA è altamente compattato; al momento della separazione i due cromatidi fratelli si separano nelle cellule figlie per diventare cromosomi.

Nell’immagine i due cromatidi fratelli si trovano affiancati.

Bandeggio G (Gimsa): si utilizza un enzima (ex tripsina) che degrada le proteine di rivestimento del cromosoma che lo rendono compatto e quindi avremo delle regioni più rilassate e regioni meno rilassate ottenendo delle colorazioni differenti. Colorazione eseguita con colorante Gimsa che si lega maggiormente alle regioni compatte dando bande scure e di meno alle regioni rilassate dando bande chiare (bandeggio cromosoma-specifico e uguale in ogni individuo).

Bandeggio Q: ….

1 Silvia Turini

Mitosi e meiosi

Le cellule non sono obbligate a dividersi ma possono rimanere quiescenti ovvero nello stato G0 interposto tra la fase M e G1 (ex neuroni).

Fasi del ciclo cellulare

• G1 fase di accrescimento cellulare (maggioranza del tempo di una cellula); i cromosomi in questa fase sono filamenti a doppia elica di DNA quindi nello stato rilassato, il centromero esiste come struttura ma non è raffigurabile.
• S fase di replicazione semiconservativa del DNA così da ottenere i cromatidi fratelli sempre nello stato rilassato (sempre 46 cromosomi ma duplicati).
• G2 in cui si completa la fase S e rappresenta una fase di controllo, se è presente un errore la cellula va incontro ad apoptosi sennò procede nella fase successiva.
• M fase di divisione cellulare in cui abbiamo la formazione dei cromosomi.

Ploidia: si riferisce a n ovvero numero dei cromosomi nel loro set aploide (noi abbiamo 46 cromosomi in 23 coppie di cromosomi omologhi e quindi abbiamo una ploidia di 2 con n=23 quindi siamo diploidi ovvero 2n).

Cromosomi omologhi: non sono identici in quanto non portano la stessa sequenza di DNA ma hanno lo stesso ordine dei geni (portano la stessa funzione ex colori occhi ecc) composti da sequenze differenti (cromatidi fratelli invece hanno stessi geni e stessa sequenza).

Cellule in divisioni sono sempre diploidi, se nella fase G1 ho un contenuto di DNA C nella fase G2 ho una quantità di DNA 2C (sempre 46 cromosomi ma ogni cromosoma è stato duplicato) e quindi nella fase M ho la cellula madre 2n 2C e le cellule figlie 2n C.

Interfase: tutte le fasi del ciclo cellulare tranne la fase M in cui non sono visibili i cromosomi in quanto sono strutture filamentose (visibile il nucleolo che presenta una quantità di DNA peculiare e più addensato ma non si vedono i cromosomi).

Il cromosoma presenta dei domini che rimangono più compatti (ex il centromero).

Cromatina: unità strutturale del DNA associato a proteine.

Mitosi

Fasi:

• Profase: i cromosomi iniziano a condensare e ad essere visibili.
• Metafase: abbiamo la formazione della piastra equatoriale e sono visibili i cromosomi.
• Anafase: disgregazione dei centromeri e migrazione dei cromosomi figli (cromatidi fratelli).
• Telofase: formazione delle cellule figlie diploidi identiche geneticamente alla cellula madre, ogni cromosoma omologo è costituito da due cromatidi fratelli.

Meiosi

Formazione dei gameti ovvero cellule aploidi (n) quindi deve avvenire una divisione riduzionale.

Fasi (abbiamo due cicli di divisione: meiosi 1 e meiosi 2):

• Profase 1: avviene il fenomeno della ricombinazione; presenta delle sottofasi.
• Leptotene: cromosomi risultano visibili in filamenti.
• Zigotene: cromosomi omologhi si appaiono (grazie all’intervento di proteine che uniscono sequenze omologhe), utile alla cellula per identificare i due omologhi e verificare un controllo sulla presenza di tutti gli omologhi, e si ha la formazione del complesso sinaptonemale in cui si verificano le sinapsi (cromosomi omologhi nell’interfase non sono vicini e all’interno del nucleo sono localizzati in regioni distinte, visualizzato attraverso le sonde).
• Pachitene: ispessimento dei cromosomi omologhi.
• Tetrade diplotene: separazione tra i cromosomi omologhi detta desinapsi e avremo solo alcune regioni dove rimangono in contatto detti chiasmi in cui si verifica una ricombinazione detta crossing-over ovvero scambio di materiale genetico (non abbiamo più i cromatidi fratelli in quanto non sono più identici, abbiamo solo cromosomi omologhi e vengono detti cromatidi ricombinanti; non è cambiato l’ordine dei geni ma è cambiata la successione).
• Profase 1 tardiva: sono sempre presenti i chiasmi (cromosomi lunghi possono avere 2-3 chiasmi, cromosomi piccoli 1).
• Metafase 1: uguale alla mitosi ma si separano i cromosomi omologhi così da ottenere una riduzione della quantità di DNA (da 2C a C e ottengo cellule figlie n).
• Telofase 1: fase transitoria in cui si ha una parziale decondensazione utile per il funzionamento di alcuni geni.
• Meiosi 2 è identica alla mitosi; differenze è che non abbiamo i cromatidi fratelli, la quantità di DNA nelle cellule figlie è C/2 con 23 cromosomi (unioni gameti ottengo 46 cromosomi e quantità di DNA C) e abbiamo 4 cellule figlie.

Metafase 2.

Risultato.

Esistono organismi che hanno una fase aploide più lunga (ex piante) in cui i gameti non vanno subito incontro a procreazione ma proliferano per mitosi sviluppando specifiche strutture e successivamente abbiamo l’unione dei gameti.

Altri organismi hanno un ciclo aplodiplonte ovvero metà del ciclo vitale aploidi e metà diploidi (ex funghi).

Ciclo riproduttivo ascomiceti

Ciclo riproduttivo ascomiceti ovvero funghi filamentosi (importanti per studio della meiosi):

Sono formati da un micelio vegetativo e un micelio aereo utili per disperdere le spore aploidi; riproduzione asessuata ovvero dispersione nell’ambiente delle spore, riproduzione sessuale abbiamo l’unione di spore provenienti da funghi differenti quindi abbiamo la fusione delle ife o con strutture differenti.

Ricombinazione

Processo voluto dagli organismi e regolato da proteine ed enzimi, non è un processo spontaneo (processo spontaneo di ricombinazione si ha quando un cromosoma viene rotto tramite ex agenti fisici).

Cromosoma omologo 1.

Cromosoma omologo 2.

Eventi:

• Rottura di un singolo filamento di DNA detta Nick su entrambi gli omologhi, incrocio dei due filamenti e unione.
• L’incrocio viene fatto scorrere di circa 20-200 nt ottenendo DNA eteroduplex ovvero quando una emielica non è perfettamente appaiata con l’altra emielica in quanto presentano una sequenza differente, possiamo ottenere la struttura di Holliday attraverso isomerizzazione (rotazione di 180°).
• Se ho taglio verticale della struttura di Holliday allora ottengo cromatidi ricombinati, mentre se ho taglio orizzontale ottengo cromatidi che terminano con lo stesso colore e quindi non abbiamo ricombinazione; entrambe le strutture però presentano DNA eteroduplex per un breve tempo in quanto viene percepito dalla cellula come una mutazione/errore e quindi tenderà a ripararlo rimpiazzando le basi non appaiate utilizzando come filamento stampo uno dei due filamenti, processo detto conversione genica (perciò nel caso del taglio orizzontale riottengo i cromatidi originali).

No ricombinazione.

Ricombinazione.

Presenza di eteroduplex venne ipotizzata attraverso le archeospore in quanto le cellule figlie presentavano un fenotipo differente dalle aspettative (non poteva essere una mutazione in quanto era troppo frequente).

Allele: sequenza di DNA che specifica per una certa caratteristica/variante (ovvero dice se ho capelli neri o biondi), quindi è variante di un determinato gene.

Gene: unità di DNA codificante per proteina ed è ereditabile (locus genico mi identifica la posizione di un determinato gene).

Locus: è una determinata posizione all'interno del cromosoma, di dimensioni variabili (un nucleotide o una regione).

Caratteristiche DNA

• Contiene le informazioni.
• Proprietà strutturali che assicurano una replicazione fedele da cellula a cellula e stabile con le generazioni (eccezioni sono le mutazioni).

Composto da deossiribosio (zucchero pentoso, molecola eterociclica in quanto ha un ossigeno al vertice) + base azotata + gruppo fosfato.

Deossiribosio: non presenta OH in posizione 2’ ma solo al 3’ (nell’RNA invece è presente in entrambe le posizioni).

Base azotata: legata al C 1’, classificate in pirimidine (anello esoso, C e T) e purine (doppio anello pentoso e esoso, A e G).

Gruppo fosfato: legato al C 5’.

Nomenclatura: base + zucchero = deossi-nucleoside (ex deossi-adenosina o deossi-citidina), base + zucchero + fosfato = deossi-nucleotide (ex deossi-adenosina monofosfato).

RNA è più labile in soluzione mentre il DNA è più stabile in soluzione e quindi è più facilmente conservabile.

Regole di Chargaff: scoprì che in tutti gli organismi vi erano delle regole sempre mantenute ovvero G=C e A=T (con quantità differenti a seconda della specie) e il rapporto purine:pirimidine=1 (A+T diverso da C+G).

Watson e Crick: costruirono un modello che rappresentava la struttura del DNA sulla base delle regole di Chargaff e altre informazioni.

Esperimenti di diffrazione della luce: fenomeno fisico per cui un'onda quando incontra un’ostacolo devia; in questo caso si usa una fonte di luce con un’unica lunghezza d’onda e con i fotoni con stessa frequenza ovvero una luce coerente (ex laser). L’utilizzo di questo fenomeno può essere utilizzato per ottenere la struttura di molecole semplici che devono essere cristallizzate ovvero le molecole vengono disidratate e si compattano a formare delle strutture ordinate.

Tecnica utilizzata per lo studio anche della struttura del DNA in cui si utilizzarono i raggi X.

Doppia elica di DNA: lo scheletro è formato da zucchero e gruppo fosfato, mentre le basi si trovano all’interno e sono planari perpendicolari all’asse dell’elica.

Presenta una polarità in cui la testa è all’estremità 5’ e la coda è all’estremità 3’ (5’->3’) direzione in cui si aggiungono anche i nucleotidi. Inoltre i filamenti sono antiparalleli.

Le basi complementari (geometria dell’appaiamento mantiene costante la forma del DNA) sono appaiate tramite legami idrogeno e anche se sono legami deboli nell’insieme mantengono stabile la doppia elica.

T=A presentano due legami ad idrogeno e infatti sono presenti nelle regioni di DNA che devono essere facilmente apribili ovvero denaturabili (denaturazione può essere eseguita attraverso un aumento della temperatura o trattandolo con soluzioni basiche forti pH=10 che vanno a indebolire la struttura; la cellula usa degli enzimi).

Struttura ad elica viene indotta in quanto in soluzione acquosa tende a compattarsi e presenta un solco minore e un solco maggiore quindi non è un’elica lineare; inoltre il DNA può presentare varie forme in soluzione che differiscono per passo e attorciglianti (ex forma Z, B e A), quindi all’interno della cellula la forma del DNA non è costante.

Replicazione del DNA procarioti

Apertura della doppia elica nelle regioni ricche di AT a 37° tramite l’utilizzo di enzimi e proteine SSB che impediscono il riappaiamento delle basi della doppia elica mascherando i punti utili alla formazione dei legami a idrogeno.

Nel DNA procariotico abbiamo un unico sito di inizio della replicazione composto da una sequenza ricca di AT e da regioni dette box composte da sequenze specifiche utili come siti di riconoscimento per le proteine. L’interazione tra proteina-DNA avviene grazie ai residui amminoacidici delle proteine che interagiscono con specifiche basi e possono tollerare delle piccole differenze con la sequenza di riconoscimento (ex proteina che riconosce sequenze ricche di AT ma la sequenza di riconoscimento presenta delle differenze l’interazione avviene uguale; per l’interazione DNA-DNA deve avvenire un appaiamento perfetto).

Eventi:

• Legame tra proteina e regioni box.
• Apertura della doppia elica con formazione della bolla di replicazione.
• Reclutamento del replisoma ovvero insieme degli enzimi che mediano la replicazione (ex DNApol e elicasi utile per mantenere aperta la doppia elica).
• Replicazione.

Reazione di polimerizzazione

Sintesi direzionata e coordinata; occorre un templato rappresentato dal filamento 3’->5’, enzima DNA polimerasi (legge il templato 3’->5’ e sintetizza il nuovo filamento in direzione 5’->3’) e i nucleotidi trifosfati utili anche per fornire l’energia. L’OH in posizione 3’ si lega al fosfato alfa, con un legame fosfoesterico, del nucleotide trifosfato con liberazione del pirofosfato (poi degradato dalla pirofosfatasi con liberazione di energia utile per stabilizzare la doppia elica replicata e rendere la reazione irreversibile).

DNA polimerasi necessita di un primer che dispone di un gruppo OH libero al 3’.

DNA polimerasi

Classificate con i numeri romani; la più diffusa e importante è la DNA polimerasi 3 con una processività di 1000 nt/sec e la DNApol 1 ha una progressività di 20 nt/sec.

DNA polimerasi procariotica è composta da un’unica proteina, mentre quelle eucariotiche sono formate da un complesso proteico.

L’attività caratteristica è un’attività polimerasica 5’->3’, inoltre hanno un’attività di correzione di bozze detta proof-reading con la funzione di idrolizzare e rimuovere i nucleotidi errati alle estremità dei filamenti detta attività esonucleasica (endonucleasi danno un taglio netto nel mezzo del DNA) e ha una direzione opposta all’attività polimerasica ovvero 3’->5’.

Le DNA polimerasi 3 e 1 hanno sia attività polimerasica sia attività esonucleasica, però la DNApol 1 ha anche un’attività esonucleasica 5’->3’ così può degradare un acido nucleico in avanti sostituendolo con un nuovo filamento.

Fenomeno detto tautomeria ovvero quando un determinato composto assume una differente struttura per un breve periodo in quanto poco stabile; ex nella citosina in cui il gruppo amminico può assumere la forma imminica dovuto allo spostamento del doppio legame dell’azoto così da permettere l’accoppiamento con l’adenina detto appaiamento non convenzionale (anche l’adenina può avere una forma imminica), mentre per timina e guanina abbiamo le forme enoliche in cui abbiamo lo spostamento del doppio legame dell’ossigeno dando un appaiamento T=G.

Queste rappresentano delle fonti di errore ovvero delle mutazioni; meccanismi della cellula per proteggersi attraverso l’attività di correzione della DNApol durante la replicazione o dopo la replicazione attraverso il meccanismo DNA mismatch repair svolto da un gruppo di enzimi.

Durante la replicazione (sia eucarioti sia procarioti) avrò un filamento principale (sintesi continua) e un filamento ritardato (sintesi discontinua).

Nel filamento ritardato abbiamo l’utilizzo di più primer (nel filamento principale ne abbiamo uno solo) sintetizzati dalla RNA primasi (possono anche presentare degli errori in quanto il loro unico scopo è quello di fare da innesco per la DNApol e successivamente rimossi) che portano alla sintesi dei frammenti di Okazaki tramite la DNApol 3.

La DNApol 3 quando incontra l’ibrido di RNA-DNA si distacca e interviene la DNApol 1 con la funzione di rimuovere il primer (30-40 nt) e sostituirlo con le basi corrette e successivamente si distacca, infine interviene la DNAligasi che unisce i frammenti con utilizzo di ATP. Comunque i due filamenti vengono sintetizzati alla stessa velocità in quanto è un processo coordinato.

Fedeltà di errore <10^-10 grazie alla correzione di bozze, risultato migliore raggiunto con la DNA mismatch repair (da 0 a 3 errori per un filamento lungo 3 miliardi di nt).

Struttura DNA eucariotico

Nucleosoma scoperto con esperimento che prevedeva l’utilizzo di una DNasi e osservazione con elettroforesi su gel, mano a mano che la digestione procedeva si formavano dei cammini su gel differenti in quanto l’enzima andava a degradare i frammenti di DNA non protetti dalle proteine fino ad ottenere una singola banda contenenti solo i nucleosomi.

Nucleosoma (spesso 10 nm) è l’unità di base della cromatina (unità strutturale del DNA), formato da DNA avvolto da otto istoni (uguali due a due, H2A H2B H3 H4) e mantenuto dall’istone H1 (proteine particolari ricche di arginina