Genetica 2

Elementi trasponibili

1.1 Definizione e conseguenze

Sono elementi che hanno la capacità di cambiare posto nel genoma.

Questo spostamento può avere conseguenze fenotipiche sull’ospite.

Possiamo incorrere in diverse mutazioni genetiche complesse come:

• Mutazioni geniche: il trasposone si inserisce all’interno di un gene, interrompendone la struttura (loss of function).
• Mutazioni cromosomiche: possono causare riarrangiamenti e traslocazioni.
• Concorrono alla struttura di geni codificanti.

I trasposoni costituiscono molti genomi e sono in grado di modificare l’espressione genica.

L’enhancer dei geni globinici contiene sequenze derivate da trasposoni che ora sono seq. regolative.

PAX6 deriva da trasposasi di trasposoni.

45% del DNA occupato da trasposoni. Quindi tutto ciò che prima era definito come junk DNA in realtà è costituito da seq. importanti che si sono conservate nel corso dell’evoluzione e che sono stati riciclati in seq. regolative o fattori trascrizionali.

I trasposoni sono presenti sia negli eucarioti che nei procarioti, possono quindi spostarsi non solo da cromosoma a cromosoma, ma anche da cromosoma a plasmide. Permettono un trasferimento orizzontale tra elementi diversi.

1.2 Storia fenotipo pianta pisello rugoso di Mendel

La causa del fenotipo rugoso è l’inserzione di un trasposone, ormai fossile, in un enzima che causa l’immagazzinamento degli zuccheri semplici in amido. L’interruzione di questo gene, ad opera dell’inserzione del trasposone, fa sì che il seme non sia più in grado di convertire gli zuccheri semplici in amido. Quando il seme cresce si gonfia perché gli zuccheri assorbono acqua, poi l’acqua evapora e raggrinzisce.

Colore pelo aguti nel topo

Topi identici, cambia l’inserzione di un trasposone vicino al gene aguti che conferisce pigmentazione del pelo.

1.3 Come identifico le sequenze trasponibili?

Osservazione di un fenotipo che non si spiega con le leggi della genetica classica.

Posso identificare trasposoni mediante evidenze: dirette, tassi di mutazione elevati, alte frequenze di reversione e instabilità genetica; indirette, instabilità riconducibile ad elementi che si spostano nel genoma; criteri molecolari, duplicazioni di seq. caratteristiche.

1.4 Trasposoni nel mais

Evidenza indiretta: ci sono dei casi in cui la colorazione delle cariossidi è un carattere instabile: ottengo cariossidi con macchie colorate.

Se incrocio linee pure ottengo cariossidi con macchie viola. Mi aspetto invece omozigoti per il colore viola. Se dovessi spiegarlo con la genetica classica, dovrei presupporre una frequenza di mutazioni in avanti e tassi di reversione elevatissimi, mutazioni, più tante reversioni, quante sono le macchie viola.

Sarebbe impossibile! Con l’analisi del genoma, si è visto che l’instabilità è riconducibile a sequenze di DNA che trovo in posizioni diverse in cariossidi diverse. Si è inoltre notato che esistono delle firme che sono lasciate dai trasposoni nei loro spostamenti, queste firme consistono in sequenze ripetute e invertite alle estremità, caratteristiche di ogni famiglia di trasposoni.

1.5 Elementi trasponibili nei procarioti

Due esempi di elementi trasponibili nei batteri sono:

• Sequenze di inserzione.
• Trasposoni.

Le sequenze di inserzione sono gli elementi trasponibili più semplici, che troviamo nel genoma dei plasmidi. Costituiscono la forma più elementare di trasposone: vi è il gene della trasposasi, fiancheggiato da sequenze palindromiche ripetute e invertite alle estremità, che la trasposasi riconosce per catalizzare lo spostamento del trasposone.

Come sono stati scoperti i trasposoni nei batteri?

Con lo studio della resistenza multipla agli antibiotici. L’insorgenza della resistenza all’antibiotico è un evento raro perciò la presenza di una resistenza multipla non si spiegava con la genetica classica.

Questo tipo di resistenza è data dall’inserzione di plasmidi che portano trasposoni che possono essere trasferiti da una specie batterica all’altra: trasmissione del carattere della resistenza.

Questi trasposoni tagliano il DNA come se fossero enzimi di restrizione, si inseriscono in modo sfalsato e richiamano la polimerasi per riparare il danno. Quando il trasposone viene exciso si formano le ripetizioni che permettono di ricostruire le trasposizioni avvenute.

I trasposoni composti conferiscono resistenza multipla agli antibiotici poiché vengono trasferiti in blocco.

1.6 Elementi trasponibili negli eucarioti

Sono stati scoperti incrociando linee pure di mais, vedi 1.4. Parto da una linea pura perché è stabile e perciò mi aspetto caratteri stabili.

Come funziona?

La colorazione del mais dipende da 3 loci: C, DS, AC.

C è il locus color, che codifica per l’enzima che mi dà il pigmento colorato.

AC e DS sono elementi trasponibili, ma DS è un trasposone defettivo, che quindi non può spostarsi da solo, ma necessita di AC per poterlo fare. AC è il trasposone integro che codifica per la trasposasi.

Se il locus C viene interrotto da DS perdo colore.

L’excisione di DS permette le diverse macchie, in quanto il gene recupera la propria integrità.

Senza AC, DS non può spostarsi, quindi se elimino AC con DS inserito nel gene, avrò il colore giallo.

Se DS exciso = colore viola.

AC, DS e C devono essere sullo stesso cromosoma? No, la trasposasi è diffusibile.

1.7 Disgenesi degli ibridi in Drosophila

Ho un fenotipo che non si spiega:

Femmina M + maschio P = progenie sterile, non c’è reciprocità dell’incrocio!

Femmina P + maschio M = progenie normale.

La disgenesi che osservo è data da un elemento trasponibile P che si muove nella germ line di Drosophila, inserendosi in tanti geni e disattivandoli, quindi il fenotipo finale sarà sterilità.

Perché non succede se incrocio maschio M e femmina P? L’elemento P può essere sia trasposasi che repressore per la trasposasi. Fa danni solo nell’uovo della femmina M perché manca il repressore per la trasposasi e quindi subisce trasposizione e disgenesi.

L’elemento P è composto da 4 esoni e può fare trasposasi o repressore della trasposasi, in base al codone di stop che viene usato.

Citotipo: possibilità di muoversi dell’elemento trasponibile.

1.8 Spostamento di un trasposone

• Effetto neutro: se va in una regione non codificante.
• Effetto dannoso: induce mutazioni.
• Effetto positivo: dà variabilità genetica.

1.9 Tipologie di trasposoni

• Trasposoni a DNA: fossili.
• Trasposoni a RNA o retrotrasposoni: per trasporsi necessitano la formazione di un intermedio a RNA, retrotrascritto in cDNA, che si integra poi nel genoma.

I retrotrasposoni si dividono in due classi:

• LTR: possiedono seq. ripetute alle estremità.
• Non-LTR: non hanno seq. ripetute alle estremità. Sono suddivisi in due sottotipi, le brevi sequenze intersperse e le lunghe.
• LINEs o L1: sono lunghe seq. di DNA, codificano per due geni, permettono la trasposizione sia di loro stessi che di altre seq. non codificanti. Rappresentano circa il 5% del genoma e contengono sequenze ORFs con omologia alla trascrittasi inversa. Possiedono retrotrasposasi per spostarsi.
• SINEs: sono brevi sequenze di DNA, raramente sono trascritte. Non codificano per la trascrittasi inversa. Le più comuni appartengono alla famiglia delle seq. Alu. Implicati in mutazioni gain of function.

Gli elementi SINEs non sono autonomi negli spostamenti e si spostano grazie alla machinery trascrizionale di L1. Conseguenza? Formazione di pseudogeni processati, dei finti geni che derivano da intermedi a RNA, riconoscibili perché hanno le caratteristiche di un cDNA: seq. codificanti, no introni, no seq. regolative. PAG 94 per approfondimento.

Esempio L1 nell’uomo

L1 è l’unico elemento LINE presente nell’uomo in grado di trasporre solitamente nella linea germinale. Tuttavia si muovono ancora nel cervello e sono coinvolti in patologie che determinano la distruzione di geni, la loro mobilitazione è riscontrabile anche nei tumori, si ipotizza che esistano dei meccanismi di repressione della mobilità di L1 che vengono disattivati nella cellula tumorale.

L1 può essere visto come un parassita che sfrutta la macchina replicativa della cellula ospite.

L’uomo presenta meccanismi di difesa che inibiscono l’espressione di questi elementi trasponibili quali la repressione di tipo epigenetico data dalla metilazione del DNA o il silenziamento nella linea germinale maschile del trasposone.

2.0 Meccanismo V(D)J

Meccanismo usato dalle cellule per produrre un vasto numero di anticorpi, si basa su reazioni di riarrangiamento del DNA. Reso possibile da 2 enzimi: RAG 1 e RAG2.

2.1 Fenotipo del bassotto

Per capire la diversità tra cani acondroplastici, zampa corta, e cani a zampa lunga eseguo un test genome wide, interrogo il genoma, e vado a vedere tutti i cromosomi e se ci sono varianti presenti nei cani bassi, che non sono presenti in quelli a zampa lunga.

Cromosoma 18: variante frequente nei bassotti.

Esiste uno pseudogene FGF4, identico al gene FGF4, che però manca di introni e poly A.

Gli pseudogeni di solito non sono trascritti, ma questo lo è, si ha quindi un’overespressione di FGF4 che blocca la crescita precocemente, favorendo la calcificazione.

Come lo pseudogene è espresso? Le seq. regolative sono fornite dal trasposone adiacente, LINE, la specificità è garantita dal 3’UTR.

Gli elementi trasponibili sono spesso usati come marcatori genetici, permettono di tracciare la storia evolutiva della specie.

Retrovirus a RNA

1.1 Definizione

Si replicano attraverso intermedi di DNA a doppia elica e infettano solo le cellule eucariotiche, sono in grado di trasferirsi orizzontalmente da una cellula all’altra.

1.2 Ciclo biologico

Attacco del retrovirus alla cellula ospite, virus penetra nella cellula ospite, trasferisce il suo RNA, che viene retrotrascritto in DNA e integrato nel genoma dell’ospite.

Sfrutta poi la RNA polimerasi 2 dell’ospite per produrre mRNA, una parte deriverà per costituire le proteine per la sintesi di nuove particelle virali, una parte si integrerà nel genoma e verrà usata come materiale genetico.

1.3 Struttura retrovirus

Composto da 2 molecole:

• Genoma compatto di RNA.
• Nucleo virale proteico, capside.
• Struttura esterna, involucro, formato da glicoproteine per riconoscimento con ospite.

RNA virale formato da:

• 2 estremità dette LTR.
• 3 unità trascrizionali: geni GAG, POL, ENV.

GAG codifica per proteine capside, ENV per l’involucro e POL per la trascrittasi inversa.

La trascrittasi inversa non ha attività di proof reading, quindi mutazioni molto frequenti! Difficoltà nel trovare vaccino!

1.4 HIV

Infetta un particolare tipo cellulare: linfociti T. In particolari individui resistenti all’HIV è presente una mutazione che impedisce la produzione del recettore di membrana CCR5, che non viene quindi riconosciuto dal virus e evita l’infezione.

1.5 Come può un retrovirus con solo 3 unità trascrizionali sintetizzare così tante proteine diverse?

• Splicing alternativo.
• Proteine di fusione.
• Riarrangiamenti.

1.6 Conseguenze infezione

L’LTR virale è un promotore/enhancer molto forte, può quindi attivare la trascrizione di molti geni diversi adiacenti. Può inoltre spostarsi rompendo il gene in cui si è integrato alterando il prodotto genico dei geni vicini e creando così proteine di fusione. In questo caso parliamo di virus trasformanti.

Questa mutagenesi da inserzione è uno dei problemi principali della terapia genica. La strategia base della terapia genica è quella di correggere il gene mutato, facendo infettare la cellula da un retrovirus che porta il gene corretto.

1.7 Gene therapy: retrovirus Moloney

Può infettare cellule in divisione, ma non cellule quiescienti, può provocare mutagenesi inserzionale portando a tumori.

1.8 Gene therapy: lentivirus

Non provocano mutagenesi inserzionale, possono infettare anche cellule che non si stanno dividendo, ma il loro genoma presenta molte proteine accessorie, difficili da maneggiare.

1.9 Vettore terapeutico

Si usano cellule dette di impacchettamento che vengono trasfettate insieme al DNA del gene terapeutico: più spezzetto il genoma, più minimizzo la probabilità di infezione.

Gag, pol ed env vengono dislocati e la cellula virale viene riassemblata in una cellula di packaging, in cui verranno inseriti 3 costrutti: uno con il gene corretto, uno che porti GAG-POL, uno che porti ENV.

CRISPR-Cas9

1.1 Storia di CRISPR

La storia di CRISPR inizia nel 1987 quando un biologo giapponese che stava studiando il genoma di Escherichia coli, nota sequenziando una porzione di cromosoma, che sono presenti delle sequenze ripetute di DNA, lunghe circa 30 paia di basi, separate da sequenze da brevi sequenze spaziatrici, spacer. Il significato biologico di queste sequenze ripetute, oggi note come CRISPR era sconosciuto.

1.2 Sequenze ripetute e spaziatrici

Si scoprì poi che queste sequenze ripetute erano presenti anche in altri batteri e archeobatteri e che sembravano essere sempre uguali, mentre le sequenze spaziatrici sembravano essere sempre diverse.

1.3 Immunità adattiva batterica

Nel 2005 si scoprì che le sequenze spaziatrici erano identiche a sequenze di DNA di virus batteriofagi, che avevano precedentemente infettato il batterio. Sembrava servire per una sorta di immunità. Quindi CRISPR doveva rappresentare una specie di difesa batterica contro le infezioni virali. La prova arriva grazie a dei microbiologi che stavano studiando i batteri dello yogurt, li incubarono con dei batteriofagi specifici e in quelli sopravvissuti, sequenziarono il genoma confermando ciò che era stato ipotizzato: le cellule avevano incorporato nella regione CRISPR del loro cromosoma un pezzo di DNA del batteriofago.

CRISPR rappresentava una forma di immunità adattiva, personalizzabile.

1.4 Geni CAS e CAS9

Si scoprirono poi dei geni associati a CRISPR. I geni CAS. In particolare CAS9, studiata dallo streptococco. CAS9 è una nucleasi con la capacità di tagliare il DNA, come gli enzimi di restrizione ma programmabile, che può tagliare il DNA in una qualsiasi sequenza di nucleotidi se gli si dice dove farlo. Le istruzioni per il taglio provengono da una molecola di RNA che si lega a CAS9.

1.5 Meccanismo nel batterio dopo infezione virale

Quindi: quando un virus infetta i batteri, per prima cosa inietta il suo DNA nella cellula. Il DNA virale istruisce i batteri a creare copie del virus. Se un batterio riesce a sopravvivere all’infezione prende un frammento di DNA virale e lo unisce al proprio cromosoma. Poi aggiunge sequenze di ripetizione CRISPR su entrambi i lati del DNA virale. Il batterio crea così una sorta di database che poi trasmetterà alle generazioni successive.

1.6 Trascrizione della regione CRISPR

Una volta che il batterio ha acquisito la seq. di DNA spaziatore nel locus CRISPR, in caso di una seconda infezione il DNA spaziatore/l’intera regione CRISPR viene trascritta in RNA, scisso poi in frammenti separati detti crisprRNA, questo viene caricato nell’enzima CAS9 e si unisce al tracrRNA, che funziona da sito di collegamento universale per il crisprRNA.

1.7 Riconoscimento del DNA virale

Se il DNA virale entra nuovamente nella cellula, il complesso CRISPR-CAS9 lo riconosce mediante appaiamento di basi complementari e lo taglia rendendolo innocuo.

1.8 Personalizzazione del complesso

È possibile personalizzare questo complesso? Sì, fondendo il crisprRNA con il tracrRNA ottengo un RNA guida, con una sequenza target specifica di mia scelta.

1.9 Prima prova per programmare CAS9

Prima prova per programmare CAS9: tagliare gene GFP, fluorescenza, in E. coli.

1.10 CRISPR-CAS9 negli eucarioti

CRISPR-CAS9 è presente anche negli eucarioti come le cellule umane? No! Però posso costruirlo e introdurlo artificialmente.

1.11 Knock-in e riparazione del DNA

Due ricercatori hanno usato CRISPR-CAS9 per introdurre, knock-in, di un nuovo gene e hanno scoperto che quando il DNA viene tagliato in una cellula eucariotica, questa cerca di riparare il danno in 2 possibili modi:

• Usa nucleotidi casuali come colla, metodo che porta allo sviluppo di mutazioni.
• Riparazione diretta dall’omologia: la maggior parte delle cellule eucariotiche sono diploidi, ovvero ogni cromosoma fa parte di una coppia di omologhi, se si danneggia uno, posso usare l’altro come stampo, come copia, per la riparazione.

1.12 DNA donatore

Ipotesi: se si può fornire un pezzo di DNA “donatore” con estremità corrispondenti alle estremità tagliate nel DNA originale, allora la cellula potrebbe considerare funzionale il DNA del donatore e riparare il taglio. Funziona!

1.13 Prospettive

Prospettive: usare crispr-cas9 per trattare malattie genetiche.

1.14 CRISPR-CAS9 e fibrosi cistica

Gene difettoso: CFTR, porta all’accumulo di muco denso.

In teoria quindi potremmo andare a sostituire il gene malato con quello sano, in pratica ogni cellula di un individuo adulto affetto da fibrosi cistica presenta il gene mutato quindi non si può fare!

1.15 Gene drive

È un segmento sintetico di DNA che include il gene cas9, un gene guideRNA e il gene di interesse. I gene drive, sono in grado di inserire o disattivare i geni di un organismo. Gli scienziati lo stanno usando per debellare la malaria. Modificando il gene doublesex hanno ottenuto una zanzara femmina con caratteristiche morfologiche intermedie tra i due sessi, quindi sterile!

N.B. per garantire l’attività esonucleasica, crispr-cas9 richiede una PAM: una sequenza di 3 coppie di basi che si trova adiacente all’estremità 3’ del sito target del DNA e facilita il riconoscimento, è specifica per omologia ad ogni cas9!

Genetica

0.1 Genetica dei caratteri quantitativi

Genetica dei caratteri quantitativi: si occupa dei così detti caratteri quantitativi, ovvero caratteri fenotipici variabili in modo continuo, come l’altezza di una pianta. Questi caratteri sono poligenici.