Genetica 2

QTL e caratteri quantitativi

QTL – quantitative traits loci (loci associati a caratteri quantitativi) sono caratteri fenotipici poligenici, quindi controllati non da uno ma da tanti geni, e multifattoriali; quindi, oltre al fattore gene, c'è anche il fattore ambiente che influisce sulla sua manifestazione. Sono caratteri quantitativi l'altezza, il peso, colore della pelle, pressione sanguigna, colore dei capelli, ecc.

Se abbiamo un carattere multifattoriale (in cui interviene anche l'ambiente) per prima cosa bisogna capire qual è la componente genetica, ovvero quant'è l'ereditabilità del carattere. I caratteri definiti da QTL si manifestano generalmente come continui, ma ci sono dei caratteri associati a QTL che hanno una manifestazione dicotoma e non continua (quindi il fenotipo c'è o non c'è). È il caso di alcune patologie, per esempio, il diabete di tipo II, displasia dell'anca, asma.

Caratteri con manifestazione dicotoma

Nei casi di dicotomia abbiamo un altro problema, capire come mai dei caratteri dovuti a più loci abbiano una manifestazione di tipo discontinuo piuttosto che continua. Osservando lo spettro dei diversi caratteri umani, si nota come siano relativamente pochi i caratteri che siano puramente mendeliani (es. beta-globina, la fibrosi cistica). La maggior parte dei tratti dipendono da un mix di determinanti poligenici e da fattori ambientali. Altri caratteri come l'altezza sono determinati da un numero di loci elevatissimo, ci sono geni che danno un contributo maggiore e altri minore.

L'altezza o il peso si distribuiscono come una gaussiana → perché più sono i geni che determinano quei caratteri, più avremo alleli e più avremo classi (con classe s'intende ad esempio una altezza, es. 1,66 e 1,67 sono 2 classi).

• Supponiamo di avere dei loci, A, B e C, che determinano il carattere X (altezza, colore della pelle, ecc.)
• Ogni locus ha delle varianti alleliche (A-a, B-b e C-c) che sono codominanti (cioè riusciamo a riconoscere nella popolazione l'eterozigote come fenotipo dal dominante e dal recessivo, ovvero vedo l'effetto di entrambi gli alleli nel fenotipo riuscirò quindi a distinguere il fenotipo AA, Aa, aa)
• Ogni allele ha un effetto additivo (normalmente un carattere quantitativo è determinato dalla somma dell'azione di più geni → additività). Per esempio, per il carattere altezza, ogni allele grande A, B, C aggiunge 10 cm a un'altezza di base: un individuo AA avrà 20 cm in più, se Aa 10 cm in più, se aa 0 cm in più.
• La frequenza di questi alleli la considero 0,5 nella mia popolazione, questo per permettermi di calcolare le frequenze dei diversi genotipi e quindi fenotipi che otterrò dall'incrocio Aa x Aa (singoli eterozigoti), AaBb x AaBb (doppi eterozigoti) e tripli eterozigoti.

Classi genotipiche e fenotipiche

Se facessi un incrocio Aa x Aa ottengo AA (¼), Aa (½) e aa (¼), quindi con un unico locus e 2 varianti, ho ottenuto 3 classi genotipiche e anche fenotipiche (perché gli alleli sono codominanti). Considerando 2 loci A e B, posso avere 5 classi fenotipiche: 4 alleli grandi AABB (40 cm in più), 3 alleli grandi (in diverse combinazioni), 2, 1 o 0 (aabb). Considerando 3 loci otterrò 7 classi fenotipiche, posso avere 6 alleli grandi, 5, 4, 3, 2, 1, 0. Aumentando il numero di loci (geni) aumento il numero di classi fenotipiche che posso ottenere, tanto maggiore avrò una curva che somiglia a una gaussiana resa ancora più continua dal contributo ambientale.

La quantità e lo spettro della variabilità umana si può spiegare con un ampliamento della genetica mendeliana (solo che ho a che fare con un numero di loci molto maggiore). Medesima spiegazione si può avere per il colore della pelle (o occhi) in cui se per esempio considero 3 geni/loci ognuno con 2 alleli, ovviamente, A sono gli alleli dark che danno un contributo per il colore, avrò 7 classi fenotipiche: aabbcc saranno bianchi, AABBCC saranno molto neri.

Regressione verso la media

Considerando una popolazione iniziale descritta da una gaussiana, agli estremi della gaussiana avrò degli individui omozigoti per tanti alleli piccoli e all'altro estremo omozigoti per tanti alleli grandi. Se questi individui si incrociassero in maniera random all'interno della popolazione (random mating), gli individui più piccoli (che hanno il maggior numero di geni omozigoti recessivi) mediamente genereranno degli individui che saranno un pochino più alti perché è più probabile che si incrocino con individui con meno alleli recessivi di quanti ne abbiano loro (es. aabbcc X AAbbcc → Aabbcc quindi il figlio è un po' più alto).

Questo vale per tutte le classi fenotipiche della prima popolazione o popolazione parentale. Se sommo tutte le progenie che ottengo dagli individui della popolazione 1 otterrò che la somma della popolazione figlia ricostruirà una gaussiana che è uguale alla popolazione parentale. Cioè la popolazione che ricostruisco sulla base di incroci casuali a partire da individui della popolazione originaria rispecchia esattamente le classi fenotipiche della popolazione originale.

Caratteri quantitativi dicotomi

Dichotomous quantitative traits – es. diabete di tipo II, displasia, asma. Per i caratteri quantitativi dicotomi, come mi spiego la manifestazione del carattere? Ipotizzo che esista un effetto soglia, ovvero se ho bisogno di avere nello stesso individuo 10 alleli predisponenti (che derivano da più geni) per avere quel carattere/patologia, questa si manifesterà solo al superare la soglia.

Se avessi un background genetico nella mia famiglia in cui sono presenti un numero di alleli predisponenti maggiori che nella popolazione, la probabilità che ho di superare la soglia è molto più elevata. Se vado a vedere la distribuzione del numero di individui affetti/non affetti nella popolazione generale, vedo che la curva della mia famiglia sarà spostata verso destra, la soglia rimane quella ma gli individui che superano la soglia sono maggiori che non nella popolazione generale.

Ereditabilità

La varianza per una gaussiana è la dispersione dei dati intorno alla media (più è stretta minore è la varianza, più la curva è larga maggiore è la varianza e quindi la dispersione). Data la distribuzione normale, quanto della varianza è attribuibile a fattori genetici e quanto all'ambiente?

All'interno della mia varianza totale/fenotipica (cioè quello che vedo nei soggetti, lo spettro dei fenotipi) ho sia la componente genetica che ambientale. L'ereditabilità è la quota della varianza s² dovuta a soli effetti genetici. L'ereditabilità h² si può esprimere quindi come varianza genetica Vg/Vp varianza fenotipica: h² = V_genetics / (V_genetics + V_environment).

Per capire il contributo della componente ambientale nell'uomo bisognerebbe avere 2 individui con lo stesso background genetico esposti ad ambienti diversi, come 2 gemelli omozigoti. Questo esperimento si può fare meglio con le piante perché se incrocio 2 linee pure nella F1 otterrò un background genetico medesimo, saranno tutte eterozigoti per quel gene, quindi non dovrei avere uno spettro ma solo una linea. Lo spettro che vedrò nella F1, la varianza/dispersione sarà dovuta quindi solo all'ambiente. Incrociando individui della F1, invece, nella F2 avrò uno spettro di genotipi, non saranno più tutte uguali genotipicamente, in questo caso la varianza fenotipica (che ovviamente sarà maggiore) sarà dovuta sia a fattori genetici che ambientali.

Esercizio

Abbiamo 2 linee pure di fagioli che vengono incrociati, alla F1 la varianza dei fagioli nel peso è 1,5 facendo incroci F1xF1 nella F2 la varianza è di 6,1. Qual è l'ereditabilità del peso nella popolazione F2? Nella F1 avrò tutte piante uguali geneticamente, quindi 1,5 è la varianza data dall'ambiente. Nella F2 ho più genotipi, uno spettro di genotipi, la gaussiana si allarga e quindi aumenta la varianza data sia da varianza ambientale che genetica = 6,1. A questo punto mi ricavo la varianza genetica 6,1-1,5= 4,6. h² l'ereditabilità sarà il rapporto fra la varianza genetica e la varianza fenotipica = 4,6/6,1 = 0,75 = 75%.

Come si mappano i QTL?

Il passo successivo è individuare quali sono i geni che influenzano quel determinato carattere:

• Incroci (non fattibile nell'uomo)
• Posso fare degli studi di associazione genome-wide GWAS

Incroci

Incrocio 2 linee pure, che siano 2 varianti per un medesimo carattere come il numero di tricomi sulle foglie. La F1 sarà eterozigote, faccio incroci F1xF1 e ottengo diversi genomi in F2, incrocio ogni individuo della F2 con sé stesso per diverse generazioni facendo in modo che diventino esse stesse delle nuove linee pure, l'una diversa dall'altra geneticamente, in cui avrò rimescolato i pezzi dei cromosomi originali.

Ognuna sarà omozigote per una piccola sezione del cromosoma parentale. Posso prendere le linee che hanno lo stesso fenotipo (es pochi peletti) e vado a vedere qual è la porzione comune a tutte le linee pure ottenute dalla F2 che mostrano pochi peletti (omozigosi di mapping). Ne deduco che questa regione sia quella che contiene il gene che m'interessa.

Studio di associazione genome-wide GWAS

Si basa sull'idea di riuscire ad associare il fenotipo con delle varianti alleliche presenti nei casi rispetto ai controlli. Quindi io non so dove si trovi lungo il genoma la variante che contribuisce a quel dato fenotipo quindi devo interrogare tutto il genoma (genome-wide). Questo implica che io debba avere dei marcatori che mi coprono tutta la lunghezza del genoma perché per tutti i marcatori che avrò a disposizione sul cromosoma 1 uno ad uno mi chiederò: "questa variante è presente in maniera significativamente diversa nei casi rispetto ai controlli?" e questo lo farò per tutti i cromosomi.

Ma i controlli quali sono? Facciamo un esempio, per il diabete di tipo 1 ho un gruppo di diabetici con le relative varianti, il gruppo di controllo sono individui sani che non hanno diabete, mi chiedo se la variante X è maggiormente presente in maniera statisticamente significativa nei casi rispetto ai controlli? Se la risposta è sì, allora chi ha questa variante è predisponente (la variante può anche essere protettiva, quindi portare a una minor probabilità di sviluppare la malattia).

Qual è la tipologia di marcatori genetici che usiamo? Sono gli SNP (single nucleotide polymorphisms) di cui se ne stimano 1 milione quindi copriamo bene il genoma. 1 SNP ogni 100-300 basi.

Risultato della GWAS evidenziano come per certe patologie, come la macular degeneration, siano solo pochi geni, in questo caso 3, che contribuiscono al 50% dell'ereditabilità, mentre per altri tratti come l'altezza siano stati identificati circa 180 loci che da soli spiegavano il 12% di ereditabilità (in uno studio di novembre 2020 i loci per l'altezza individuati erano 10.000 che spiegavano l'80% di h²).

Per un carattere complesso come il morbo di Crohn in cui 70 loci contribuiscono al 20% dell'ereditabilità dal punto di vista della terapia ci posso fare ben poco. Per la macular degeneration invece posso in qualche modo intervenire.

Sequenza del genoma umano

A cosa mi servirebbe avere l'intera sequenza del genoma umano? Per capirne la struttura, la storia evolutiva di un gene, la sua conservazione, le varianti (ogni 300 bp nella popolazione umana abbiamo un polimorfismo), scoprire varianti associate a malattie, posso costruire un catalogo della variazione umana. L'istituto SANGER che si occupa di genomica ha una banca dati di 65-70 petabyte (2⁵⁰ byte).

Come s'identifica e studia un gene all'interno del genoma?

Devo innanzitutto capire dove si trovano i geni e la loro struttura (con il promotore, introni, esoni, ecc.). Per isolare un gene e ricostruire un genoma si usano le librerie di DNA, cioè una collezione di frammenti di DNA rappresentativi del DNA di un dato organismo, clonato in vettori in modo da averli isolati e identificati. La lunghezza di questi frammenti dipende fondamentalmente dal vettore di clonaggio che viene utilizzato. I plasmidi, fago lambda, cosmidi fino ai yeast artificial chromosomes (YACs). Questi sono alcuni vettori di clonaggio. I plasmidi contengono dei frammenti relativamente piccoli (5-10 kb max), il fago lambda fino a 15 kb, i YACs più di tutti (3 Mb).

I vettori di clonaggio quindi sono delle molecole a sequenza nota:

• In grado di replicarsi indipendentemente nella cellula ospite in modo che possa mantenere dei cloni del frammento che m'interessa
• Siccome poi questo vettore lo dovrò inserire dentro un vettore di espressione (es. trasfettare coli) deve possedere dei marcatori che permettano il riconoscimento nelle cellule che hanno acquisito il vettore (es. un marcatore è la resistenza agli antibiotici)

Mediamente un gene è lungo sulle 50 kb, se usassi un plasmide il mio gene verrebbe spezzettato in 4-5 cloni diversi che poi devo ricostruire. Devo quindi calcolare la dimensione dell'inserto ottimale che vorrei all'interno del vettore.

Cosa contiene un vettore plasmidico

• Marcatore di selezione → di solito è una sequenza per la resistenza all'antibiotico
• Origine di replicazione → per la replicazione autonoma all'interno del batterio
• MCS sito multiplo di clonaggio → in cui si trovano vari siti per diversi enzimi di restrizione. Di solito l'MCS si trova all'interno del gene lacZ (il lattosio lega il repressore che blocca la trascrizione dell'operone lac e quindi promuove la formazione degli enzimi) che codifica per la beta-galattosidasi che in presenza di substrato X-gal (sostituto del lattosio) lo metabolizza e se c'è anche l'induttore IPTG (che sequestra il repressore al posto del lattosio) dà un composto blu. Se il mio inserto DNA si è inserito bene nel plasmide, il gene lacZ viene interrotto e quindi avrò colonie bianche perché non avrò gli enzimi per avere il prodotto blu.

Se voglio costruire la mia libreria usando vettori plasmidici, digerisco con lo stesso enzima di restrizione sia il vettore nel MCS che il DNA genomico d'interesse (le estremità desiderate le ho ottenute tramite PCR, usando degli oligonucleotidi artificiali), in presenza di DNA ligasi ligo i frammenti all'interno dei vettori → ho ottenuto il mio vettore di clonaggio pronto per essere trasfettato. Trasformo E. coli con questi vettori e poi farò la selezione con antibiotico (uccido quelli che non hanno la resistenza all'antibiotico, quindi che non hanno il vettore), poi seleziono quelle bianche (che avranno anche l'inserto). Avrò un catalogo in cui ogni clone contiene un frammento diverso di DNA genomico.

Il problema è che voglio fare una libreria di un genoma come quello umano 3 miliardi di bp con una lunghezza media dei geni di 50 kb è più opportuno andare su vettori che contengono sequenze un po' più grandi, come il fago lambda che contiene 15 kb di DNA esogeno.

Vettore fago lambda

Ha 2 cicli:

• Ciclo litico → è immediato e provoca subito la lisi del batterio. L'infezione porta alla produzione di nuove particelle virali che vengono rilasciate.
• Ciclo lisogenico → il fago integra il proprio DNA all'interno del genoma del batterio e rimane in attesa di segnali di induzione (cibo, fattori ambientali), quindi riprende il ciclo litico. I geni per il ciclo lisogenico non sono essenziali per la sopravvivenza di fago lambda quindi posso levarli e sostituirli con i miei geni di interesse (occupavano 15 kb circa, quindi tanto tolgo e tanto metto, in totale fago lambda ha un genoma di 45 kb).

Digerisco con lo stesso enzima di restrizione sia il genoma di fago lambda che il DNA da essere clonato (es. uso EcoR1). Vengono eliminati i geni per il ciclo lisogenico e all'interno di lambda vengono clonati i frammenti che derivano dal genoma che voglio clonare in modo da ricostruire un frammento di DNA che ha più o meno le dimensioni del fago lambda e verrà inserito nel capside virale. In piastra poi vedrò le cosiddette placche di lisi, ovvero quando il fago infetta il batterio ne provoca la lisi e il rilascio delle particelle virali con il mio inserto di interesse clonato.

Possiamo decidere di volere degli inserti più grandi, abbiamo a disposizione dei cosmidi (ibrido artificiale fra i lambda e i plasmidi), i BAC, Yeast Artificial Chromosome (YAC), ecc.

Librerie a cDNA

Il cDNA è il DNA complementare, ottenuto dalla trascrittasi inversa di un mRNA. Se dovessi confrontare librerie di DNA per diversi tipi cellulari non avrei alcuna differenza, la sequenza nel genoma rimane la medesima (per uno stesso individuo). Se invece guardo le librerie a cDNA allora vedrò delle differenze, una libreria a cDNA sarà l'immagine del trascrittoma di quel tipo di cellula in quel dato momento di sviluppo, ci sarà differenza fra una library di una cellula di un tessuto piuttosto che di un altro, questo perché il cDNA deriva dall'mRNA e ogni cellula esprime un proprio repertorio di mRNA (ad eccezione dei geni housekeeping, onniespressi).

Nel caso volessi fare una libreria a cDNA devo innanzitutto estrarre l'mRNA della cellula, poi grazie a trascrittasi inversa sintetizzo il cDNA corrispondente. Queste sequenze nucleotidiche non sono lunghe come un intero gene soprattutto a causa della rimozione degli introni nello splicing, quindi il vettore per il clonaggio in cui inserisco il cDNA ottenuto può benissimo essere un plasmide da inserire in un batterio.

Un vettore di espressione necessita anche di sequenze regolative, per questo nel vettore di clonaggio inserisco anche un promotore e un segnale di terminazione. Il promotore può essere forte, debole o una via intermedia, ma anche inducibile. Abbiamo creato vettori con diversi tipi di promotori (di solito si usa il promotore del citomegalo).